材料和试剂

一次性培养皿（克伦威尔集团，目录号：STS3855002B）
L型细胞扩散器（Fisher Scientific，目录号：14-665-231）
一次性接种环（Sigma-Aldrich，目录号：I8388）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
蛋白质LoBind管（Eppendorf，目录号：022431102）
20 ml塑料普通（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：128BFS）
塑料密封袋（Fisher Scientific，目录号：10366984）
制造商：MINIGRIP，目录号：BAJ-340-091N。
Pierce ^{TM旋转柱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：69725）}}
一次性无菌手术刀10号（WMS，目录号：W259）
10μl过滤嘴（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne ^®，目录号：S1121-3810）
20μl过滤嘴（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne ^®，目录号：S1120-1810）
200μl过滤嘴（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne ^®，目录号：S1120-8810）
1,000μl过滤嘴（STARLAB INTERNATIONAL，TipOne ^®，目录号：S1122-1830）
脑膜炎奈瑟氏球菌（L9153和MC58，英国公共卫生局）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010001）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
人血清（Sigma-Aldrich，目录号：H6914）
疾病状态血清（获得这种变化，取决于正在研究的病原体）
Pierce ^TM蛋白A/G UltraLink ^{TM树脂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：53132）}}
SeeBlue ^®蛋白质标记（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：LC5925）}
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I6125）
（Thermo Fisher Scientific，Novex< sup>，目录号：NP0004）的10x样品还原剂）
Invitrogen（株）Supex TM Supex TM Supex TM Supex TM 4/LDS加载缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Novex TM，目录号：NP0007 ）
Invitrogen（株）Supp。TM Supex TM Supp。TM Supe12％Bis-Tris 1 mm-10孔（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM >，目录号：NP0341BOX）}
Invitrogen Supreme TM NuPAGE ^{TM MOPS运行缓冲液20x（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NP000102} ）}
SimplyBlue ^TM安全污渍（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：LC6060）
用于HPLC-MS的乙腈（Fisher Scientific，目录号：10616653）
碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，目录号：09830）
胰蛋白酶金，质谱级（Promega，目录号：V5280）
哥伦比亚血琼脂碱（Oxoid，目录号：CM0331）
马血，脱纤维（Oxoid，目录号：SR0050）
Tris碱（Roche Diagnostics，目录号：10708976001）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
甲酸LC/MS（Fisher Scientific，目录号：A117-50）
用于HPLC-MS的水（Fisher Scientific，目录号：10777404）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：179957-1L）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
CAB培养基（见食谱）
PBS加1％BSA（参见食谱）
溶解缓冲液（见配方）
1％SDS（参见食谱）
1 M二硫苏糖醇储液（参见食谱）
1 M碘乙酰胺（见配方）
25 mM碳酸氢铵（见配方）
25％碳酸氢铵中的乙腈（50％v/v）（见配方）
乙腈（50％v/v）（见配方）
溶剂A用于HPLC（参见食谱）
HPLC溶剂B（见配方）
0.1％甲酸/50％乙腈溶液（参见食谱）

设备

Gilson Pipette Pipetman Classic P2（Gilson，目录号：F144801）
Gilson Pipette Pipetman Classic P20（Gilson，目录号：F123600）
Gilson Pipette Pipetman Classic P200（Gilson，目录号：F123601）
Gilson Pipette Pipetman经典P1000（Gilson，目录号：F123602）
Eppendorf ^®微型离心机5415R（Eppendorf，型号：5415 R）
BOD低温冷藏培养箱（VWR，型号：BOD Incubator 2005，目录号：35960-056）
CO 2培养箱（LEEC，型号：Culture Safe Precision 190D）
斯图尔特旋转摇杆（Cole-Parmer，Stuart，型号：SSL3）
Vortex Mixer SA8（Cole-Parmer，Stuart，型号：SA8）
超声波浴（Fisher Scientific，型号：Fisherbrand ^TM S系列，目录号：10611983）
Ultimate 3000纳米HPLC系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：UltiMate ^{TM 3000/RSL Cnano系统）}}
Acclaim ^TM C-18 Pepmap ^TM列（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：164569）
QSTAR ^® XL混合LC/MS/MS系统（Applied Biosystems，型号：QSTAR XL Hybrid LC/MS/MS系统）
Eppendorf MixMate ^TM（Fisher Scientific，目录号：21-379-00）
制造：Eppendorf，目录号：022674200。
Eppendorf ThermoStat Plus可互换块加热器（Eppendorf，型号：ThermoStat Plus，目录号：022670204）
Eppendorf Vacufuge ^TM浓缩器（Eppendorf，型号：Vacufuge ^{TM浓缩器，目录号：022820001）}
Heraeus管辊Spiramix（Fisher Scientific，目录号：10600653）
制造商：Thermo Fisher Scientific，Thermo ScientificTM，产品编号：DS507。
通风柜

软件

Chromeleon v6.8或更高版本（Dionex，Thermo Fisher Scientific）
分析师QS 1.1（Applied Biosystems）
Mascot v2.2.04或更高版本（Matrix Science，London）

程序

细胞表面免疫沉淀
1. 成长。来自冷冻原料的脑膜炎脑膜炎：用无菌200μl提取物获得少量冷冻培养物，接种哥伦比亚琼脂碱（CAB）板并铺展以产生单个菌落。在35℃下用5％CO 2孵育过夜（〜18小时）。收集20-30个菌落，并使用无菌环扩散到CAB板的整个表面，并在35℃下用5％CO 2孵育4小时。个别殖民地在这个阶段不会被看到。
2. 通过向板中加入PBS并使用无菌环将菌落混入PBS中来回收细菌。使用P1000微量移液管取出PBS /细菌悬浮液（每片1ml，每次免疫沉淀使用半片），室温下以13,000 xg离心2分钟，用1体积PBS洗涤沉淀3次加1％BSA。对于这些和随后的洗涤步骤，通过在室温下以13,000 x g离心2分钟，沉淀细胞，除去上清液，加入新鲜的缓冲液并重悬浮颗粒。
  注意：
  1. 如果使用液体培养而不是平板，我们建议在对数生长期和在有利于表达毒力因子的条件下收获细胞。我们建议研究人员利用其生物体进行生长曲线，或者了解生物体如何在液体培养基中生长以便能够正确识别生长期。
  2. 离心条件可能根据所讨论的细菌而变化。裂解细胞的存在将增加对非表面蛋白质的选择。
  3. 尽一切努力确保早期离心步骤不会破坏细胞，同时去除分泌的蛋白质或裂解的死细胞的组分（见注2）。
3. 在1ml血清样品中悬浮沉淀（对照或试验[分别为材料和试剂列表的项目17和18]），并在4℃下旋转90分钟。
  注意：在对照血清样品中鉴定的蛋白质在将来的分析中应该被忽略，因为它们可能在针对病原体的免疫应答中起不到任何作用。研究人员应确保他们所控制的血清对他们正在调查的病原体确实是阴性的。
4. 将细胞（13,000 x g，5分钟，RT）造粒，并用PBS加1％BSA洗涤两次。
5. 将细胞重悬于1ml溶解缓冲液中，37℃孵育60分钟
6. 离心样品（13,000 x g，60分钟，RT），收集上清液，并用蛋白A/G UltraLink珠（50μl）在4℃下搅拌或滚动孵育18小时。
7. 离心样品（2,500 x g，2分钟，RT），收集珠子。
8. 用1体积溶解缓冲液洗涤珠子5次（2,500×g，2分钟）。
9. 洗脱抗体：1体积SDS（1％）和沸腾（10分钟）的抗原复合物
10. 加入4体积的水并涡旋洗脱蛋白质。离心机（2,500 x g，3 min，RT），收集上清液;体积的增加允许在涡旋期间更有效地去除蛋白质。
11. 将样品浓缩至50μl，使SDS浓度回复至1％（使用Speed-Vac在45°C约45分钟）。此时，可以将样品与加载缓冲液混合并在SDS PAGE凝胶上运行。继续步骤B1。如果样品正在准备进行质谱分析，则蛋白质可以在分离前进行还原和烷基化。通过加入DTT至终浓度为10 mM并煮沸2分钟（50μl，加入0.5μl1 M DTT原液），减少洗脱的蛋白质。
12. 加入碘乙酰胺至终浓度为50 mM（50μl，加入2.5μl1M IAA储备溶液），并在黑暗中室温孵育30分钟。
1D SDS-PAGE和样品消化
1. 将减少的烷基化样品与加载缓冲液（材料和试剂列表的项目23）混合并煮沸5分钟。
2. 通过SDS-PAGE（12％，1 mm厚，10 cm长）分离蛋白质。
3. 用SimplyBlue ^{TM染色1小时，用超纯水去污（根据制造商的说明书，见图1）。
  
  图1.脑膜炎球菌的免疫沉淀（IP）表面蛋白的代表性图像。转载自Newcombe 等人（2014）。}
4. 根据样品蛋白质浓度，根据需要切割凝胶泳道，并将切片置于低蛋白质结合管中注意：一个完整的凝胶泳道可以切割成20个切片，但是只需要运行一个缩短的凝胶并将其切成5个切片。
5. 用50％乙腈在25mM碳酸氢铵中洗涤凝胶片两次，在室温下涡旋15分钟以除去污渍用量足够的体积以覆盖凝胶片。
6. 通过与100％乙腈（20分钟，室温）孵育脱水凝胶切片
7. 使用Speed-Vac干燥（约20分钟）的干凝胶片。
8. 在含有修饰胰蛋白酶的25mM碳酸氢铵（12.5ng /μl，终体积将取决于凝胶切片的大小，4℃10分钟）中再水化。如果需要，加入更多的25mM碳酸氢铵以覆盖凝胶片，在37℃下孵育过夜
9. 除去消化液，通过与30μl0.1％甲酸/50％乙腈孵育20-30分钟提取消化的蛋白质20分钟，振荡，然后在超声波浴（40 kHz）中重复一次，每次收集上清液。 />
10. 使用Speed-Vac彻底干燥提取的消化蛋白，并重悬于20μl水中。储存于-20°C。
液相色谱 - 电喷雾离子化MS/MS（请参见注释）
1. 使用Ultimate 3000 HPLC和C18 pepman（Dionex）柱在40℃，350nl/min，2-50％溶剂B梯度洗脱30分钟，90％溶剂B，用Chromeleon软件控制5分钟，分离肽。 />
2. 将QSTAR XL设置为2.3 kV电喷雾，8个任意单位的帘式气体，以及400至1200 m/z的1秒测量，充电状态2-4。
3. 通过分析员QS 1.1软件获取信息数据采集的MS数据。
4. 为MS/MS选择最大强度的产品离子，其中m/z 为65和1,200 amu。
数据库分析（请参见注释）
1. 向Mascot Server（v2.2.04; Matrix Science）提交MS/MS谱的峰列表，并使用MS/MS离子搜索程序进行分析。
2. 允许多达一个缺失的胰蛋白酶切割与固定修饰的氨基甲基（C）和可变的氧化修饰（M）。
3. 将肽和MS/MS片段的耐受度分别设置为1.2和0.6Da，并选择MH ^{2 +}和MH 3+/sup>作为前体充电状态
4. 搜索确定的蛋白质与国家生物技术信息中心非冗余（NCBInr）数据库，其分类集为。脑膜炎病毒分类法（分类代码487）。使用正在使用的生物体的适当数据库分析数据。

数据分析

一旦获得了确定的蛋白质的列表，应检查它们以确保所有的蛋白质都被表面暴露。这可以使用诸如PSORTb v3.0（Yu等人，2010），CELLO v2.5（Yu et al。，2004）和2006）或Gneg-mPLoc（Shen and Chou，2010）。搜索信号肽或脂质化也是有用的。我们推荐使用以下工具：LipoP 1.0（Juncker，2003），SignalP 4.1（Petersen等人，2011），Signal-CF（Chou and Shen，2007）和PrediSi（Hiller < et al。，2004）。为了进一步评估蛋白质位置预测，鼓励研究人员寻找β-桶蛋白，并排除含有跨膜α-螺旋的蛋白质（请注意，此构象"规则"不适用于脂蛋白，仅适用于外膜蛋白）。
有几种技术来实验地评估预测的蛋白质的位置，并且它们根据正在研究的细菌而变化。细胞分级随后是Western印迹，间接免疫荧光（未固定的样品）和细胞表面蛋白水解等技术也是合适的。为了评估脑膜炎球菌候选蛋白的定位，我们制备了候选蛋白的血清，用该血清探测完整细菌，并加入FITC缀合的二抗，并通过流式细胞术分析单细胞。如图2所示，荧光的检测将证实给定候选蛋白的表面暴露。请参阅2014年的Newcombe等人。有关此技术和我们使用的其他技术的更多细节。 />

图2.流式细胞术实验的代表性数据，以评估候选蛋白是否是表面暴露的。用表面暴露蛋白和FITC的血清探测的细胞显示出更强的信号（灰线）阴性对照（黑线）。从Newcombe等人转载（2014）。

笔记

应根据对感兴趣的细菌的免疫力来选择血清样品，这可以是已显示赋予免疫力的健康血清或针对目标生物体特异提高的血清。针对抗原的抗体滴度将决定免疫沉淀足够的抗原蛋白所需的血清量
除免疫沉淀蛋白质的SDS-PAGE之外，我们还建议进行蛋白质印迹以确认免疫原性蛋白质的存在。其他蛋白质条带的存在将表明非特异性蛋白质的提取。运行对照包括抗体阴性样本是至关重要的。有必要确保血清含有对细菌的抗体。血清的滴度将影响免疫沉淀可检测水平的特异性免疫原性蛋白质所需的量。还建议使用血清对非表面蛋白质（例如，周质蛋白质，内膜蛋白质等）进行检测，以确保不会污染不属于蛋白质的蛋白质表面暴露。
免疫沉淀的步骤A7可以使用旋转柱或小心地从上清液中移出来进行
质谱参数特异于研究人员可用的仪器。我们在这里报告我们使用的规格，但研究人员应参考自己的设备说明，了解如何更好地调整设备。还有其他方式来分析MS文件（过程D）。其他软件和方法可用。我们在这里展示了我们在分析中纳入的软件。建议将免疫沉淀的样品分开或分析多个样品，以提高数据的可靠性。
用于质谱仪分析，质谱仪数据收集和随后数据分析的肽的制备将取决于进行分析的设备。如果这是在内部或外包在准备样品前讨论样品制备。所有设施都设定了确保最大输出的程序。

食谱

CAB媒体
39克哥伦比亚琼脂基地
蒸馏水至1升
高压灭菌器（121℃，15分钟）
冷却至50°C，加入6％无菌去纤维化血液
PBS加1％BSA
1克BSA
PBS至100ml最终体积，保持冷藏
溶解缓冲液
3.0028g Tris，50mM，pH7.8。
4.38克NaCl，150毫升 0.146g EDTA（或从500mM储备溶液稀释），1mM
1％（v/v）Triton X-100
1g脱氧胆酸钠，0.2％
0.5克SDS（或从通风橱中的10％储液重量稀释），0.1％
蒸馏水（最终体积为500毫升）
1％SDS
1克SDS
100 ml LC/MS水通风柜重量
1 M二硫苏糖醇溶液
1.542克DTT
LC/MS水至10ml，保持-20°C 通风柜重量
1 M碘乙酰胺储备溶液
1.84 g IAA
蒸馏LC/MS水至10 ml
25 mM碳酸氢铵
0.998克碳酸氢铵
LC/MS水至500 ml
乙腈（50％v/v）在25 mM碳酸氢铵中 50ml乙腈
50ml碳酸氢铵（见上文）
乙腈（50％v/v）
50ml乙腈
50ml LC/MS水
溶剂A用于HPLC
2ml乙腈
0.1毫升甲酸
97.9 ml LC/MS水
溶剂B用于HPLC
90 ml乙腈 0.1毫升甲酸
9.9 ml LC/MS水
0.1％甲酸/50％乙腈溶液
0.1毫升甲酸
50ml乙腈
49.9 ml LC/MS水

致谢

作者声明没有利益冲突。此协议之前已经被我们描述过（Newcombe等人，，2014）。赛诺菲巴斯德资助这项研究。 CNPq和CAPES资助了其他革兰氏阴性物种的适应性。

参考

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