材料和试剂

移液器提示
1.5 ml Eppendorf管
Millipore0.22μm孔径过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
9厘米无菌培养皿
电穿孔试管0.2厘米间隙（Bio-Rad实验室，目录号：1652082）
用于细菌电镀的玻璃珠（VWR，目录号：201-0279）
pKD267质粒（描述于Maisonneuve等人，2011）
pKD46质粒（在Datsenko和Wanner，2000中描述）
展开高保真DNA聚合酶（Roche Molecular Systems，目录号：11732641001）
IpI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0176）
PCR纯化试剂盒（5Prime，目录号：2300610）
质粒纯化试剂盒（Roche Molecular Systems，目录号：11754777001）
4℃冷冻无菌蒸馏MilliQ水
蒸馏MilliQ水
氨苄西林钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
L-阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1876）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
Bacto胰蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
细菌酵母提取物（BD，Bacto ^{TM，目录号：288620）}
氯化钠（NaCl）（VWR，BDH ^{，目录号：102415K）}
欧洲细菌琼脂（Conda，目录号：1800）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：71645）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
硫酸镁（MgSO 4）（VWR，BDH，目录号：291175X）
维生素B1（硫胺素）（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
L-鼠李糖一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：R3875）
氯化钾（KCl）
Na 2 HPO 4/12H 2 O
甘油（v/v）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Luria-Bertani（LB）肉汤培养基（见食谱）
Luria Bertani盘（见食谱）
M9（10x）（见配方）
CaCl 2/MgSO 4溶液（100x）
M9最低介质（见配方）
M9-鼠李糖板（参见食谱）
磷酸盐缓冲液（PBS）（见食谱）
10％无菌甘油（见食谱）
L-鼠李糖（见食谱）

设备

选择单道移液管（2μl，20μl，20μl，1,000μl）（Gilson，P-2，P-20，P-200，P-1000）
玻璃瓶100ml（Fisher Scientific，Fisherbrand）
玻璃50ml烧瓶（Fisher Scientific，Fisherbrand）
MiniSpin ^® Eppendorf台式离心机（Eppendorf，型号：MiniSpin ^®）
细菌培养箱（Eppendorf，New Brunswick，型号：Innova 4000）
MicroPulser ^TM电穿孔机（Bio-Rad Laboratories，型号：MicroPulser Electroporator，目录号：1652100）
Eppendorf冷冻离心机（Eppendorf，型号：5804）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：SPECTRONIC ^TM 200）
Milli-Q ^®超纯水（Nanopure）水净化系统
DNA SpeedVac（Savant Systems，型号：SpeedVac DNA 110）
高压灭菌器（Prestige Medical，目录号：210004）

软件

GraphPad Prism软件（ https://www.graphpad.com/scientific -software /棱镜/）

程序

该程序仅用于研究能够从培养基中吸收鼠李糖的细菌物种和ParE毒素功能的物种携带的质粒的稳定性。在尝试将这一程序适应新物种之前，应该考虑这一点。尽管我们采用这种测定来测量肠炎沙门氏菌的毒力质粒的稳定性。肠毒素 serovar Typhimurium str。 SV5015（Lobato-Marquez等人，2016），该方法对于E也是有用的。大肠杆菌质粒。

重组质粒变体的设计
1. 使用pKD267质粒作为模板并扩增高保真DNA聚合酶（〜1,800bp），通过聚合酶链反应（PCR）扩增aph-parE 盒（参见注释1和2，表1和图1）。建议使用以下PCR程序：94℃5分钟，[94℃30秒; 60℃30秒; 72℃2分]×10，[94℃30秒; 60℃30秒; 72°C每周期2分+ 5秒增量）×25次循环
2. 通过每50μlPCR反应加入1μl的DpnI，对PCR扩增的aph-parE 盒进行消化。 Dpn我消化甲基化DNA，从而消除了亲本pKD267质粒，而不是扩增的aph-parE DNA模块。
3. 使用5Prime PCR纯化试剂盒纯化I-digested PCR反应的 Dpn。在MilliQ水中洗脱DNA。或者，可以使用诸如苯酚/氯仿沉淀法的标准沉淀方法来纯化DNA片段（参见附注3）。
4. 使用DNA SpeedVac将纯化的PCR产物浓缩至500-800ng /μl。
5. 用pKD46转化含有待分析稳定性的质粒的菌株（见附注4和图3）。在30℃下生长含有50μg/ml氨苄青霉素的LB的变体
6. 制备携带pKD46的菌株的电感受态细胞（图3）。挑取携带pKD46质粒的新菌株的一个菌落，并接种5ml补充有50μg/ml氨苄青霉素和0.4％阿拉伯糖（w/v）的LB。在100毫升摇瓶（约150转/分钟）的烧瓶中，将培养物在30℃下在10ml LB培养物中培养16小时。
7. 将电穿孔pKD46感受态细胞（2.5kV，5ms）与800-1,000ng纯化的aph-parE DNA片段（图3）连接，并在37℃下培养细胞3小时（该温度促进损失的pKD46）
8. 在含有50μg/ml卡那霉素和0.2％葡萄糖的LB平板中的板电穿孔细胞（参见注释5）。
9. 使用PCR确认您的质粒中 aph-parE 盒的正确整合。
  
  图3.总结重组质粒变体设计的方案
质粒稳定性分析
注意：在开始测定之前，请参阅注释6.
1. 在37℃和150rpm下，在100ml烧瓶（10:1烧瓶：中等体积比）中将10ml无LB的细菌培养物接种在无选择压力下。通过测量光密度（600 nm），始终调整所有使用菌株的接种量。根据所需的细菌代数培养培养物（见注释7和8）。例如，该协议针对肠炎沙门菌子项进行了优化。肠杆菌血清型鼠伤寒沙门氏菌在37℃（〜10代）生长16小时。
2. 在1.5 ml Eppendorf管中收集1 ml生长的培养物。
3. 使用台式离心机（MiniSpin，Eppendorf）在室温下以约10,800 x g的速度离心1分钟，或在不同台式离心机中等效的速度。
4. 丢弃上清液，并用1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（见注9）清洗细菌沉淀两次。将细菌沉淀重悬于1 ml PBS中
5. 使用100μlPBS重悬细菌培养物在含PBS的Eppendorf管中进行1:10连续稀释。
6. 通过使用玻璃珠将100μl适当的稀释液平板放置在LB平板和M9-鼠李糖板上。必须根据研究的质粒调整适当的稀释度（见注释10和11）。
7. 在计数菌落形成单位数（CFU）之前，在37℃下培养板24小时（LB-琼脂）或48-72小时（M9-鼠李糖琼脂）（见附注12）。
8. 为了放弃假阳性，应在M9-鼠李糖琼脂中生长的CFU通过将其贴在含抗生素的LB平板上来测试他们的卡那霉素抗性。

数据分析

计算M9-鼠李糖和LB板中的CFU数量
分离子级分（已经失去研究的质粒的细菌的分数）可以计算为LB中的"M9-鼠李糖"/'CFU/ml中的每毫升数的CFU（Lobato-Marquez等人， em>。，2016）。
通过测试或单因素方差分析分析菌株之间的稳定性差异。如果使用方差分析，则可以采用事后检验来确定所有菌株（Tukey's检验）之间的平均差异，或者将检测菌株与对照菌株（Dunnett's检验）进行比较。我们建议使用GraphPad Prism软件（La Jolla，USA）

笔记

该稳定性测定基于将 aph-parE 盒插入感兴趣的质粒/基因。盒式集成程序根据Datsenko和Wanner（2000）描述的原始方法进行了调整，并在图1中进行了总结。
引物设计和aph-parE扩增：结合pKD267质粒的 aph-parE 区域的设计寡核苷酸（表1）。在pKD267序列退火的5'-末端，引物必须含有与所需插入位点的上游（正向）和下游（反向）区域同源的50bp（图1，表1）。为了测试感兴趣的质粒的稳定性，必须将 aph-parE 盒插入质粒的不涉及质粒稳定性的区域。如果测试特定基因对质粒稳定性的贡献，则必须以这样的方式插入目标基因被破坏（优先也使该基因的启动子失活以避免极地效应）
表1.使用pKD267 入门名称
引物序列（5'-3'）
用于
正向3'末端
TCTCTACGCCGGACGCATCGTG
放大aph-parE 磁带盒
反向3'末端
ACTGATCAGTGATAAGCTGTC
放大aph-parE 磁带盒
Km-Comp5
CACGATGCGTCCGGCGTAGAG
检查aph-parE 插入
Km-Comp3
GACAGCTTATCACTGATCAG
检查aph-parE 插入

当设计正向3'末端和反向3'端引物时，有必要将50bp同源于插入位点（见图1）。
当纯化 aph-parE 盒时，重要的是尽可能多地除去盐，以防止随后的电穿孔产生干扰。
pKD46质粒是编码λ-Red重组酶的热敏质粒，其将 aph-parE 盒整合到质粒的所需区域中。在阿拉伯糖存在下诱导λ-Red重组酶合成。一旦用pKD46质粒转化，所得到的重组菌株必须在30℃和50μg/ml氨苄青霉素存在下生长，直到用aph-parE片段进行电穿孔。
在将 aph-parE 盒插入感兴趣的质粒后，强烈建议在0.2％葡萄糖存在下总是生长细胞。葡萄糖抑制启动子，因此避免由ParE合成引起的任何可能的毒性。
稳定性测定：在计算所需代数之前，总是在存在50μg/ml卡那霉素的情况下生长细菌。这将确保开始实验，开始含〜100％含细菌的质粒。
如果比较含有不同质粒衍生物的几种菌株，研究人员应确认所有菌株的生长速率是相同的。不同的生长速率意味着不同数量的细菌代，因此会产生分离子分数的差异。
该方法用于测量〜10代后pSLT质粒的质粒稳定性，并且能够检测2×10 6个细菌中的〜1个分离物（Lobato-Marquez等人）。，2016）。由于所述测定的高灵敏度，我们强烈认为，该过程可能适应于以较少代数识别无质粒细胞。
在选择的条件下培养细菌培养物后，培养液必须用1ml PBS洗涤两次以除去痕量的LB培养基。 M9-鼠李糖琼脂平板必须含有鼠李糖作为唯一的碳源。鼠李糖启动子经受分解代谢抑制，意味着其他碳源（如葡萄糖）抑制了parE的表达，因此可以防止无质粒细胞的阴性选择。
PBS，LB培养基和M9-鼠李糖板必须保持无菌。如果含有 aph-parE 盒的细菌培养物被含有不含aph-parE的菌株污染，则在对卡那霉素也敏感的M9-鼠李糖板中将产生假阳性菌落。 br />
工作稀释液：作为例子，对于高稳定性的pSLT毒力质粒。使用1:10 <7>稀释法定量LB-琼脂平板上的总细菌总数，稀释液使用范围1：1-10 ³来确定M9-鼠李糖琼脂平板上的分离物数量。
M9-鼠李糖板不应在37℃下保存72小时以上，重复率极低的细菌除外。我们已经观察到，ParE毒素活性比杀菌剂更具杀菌性，这意味着在37℃下长时间培养含有质粒的细胞将会生长。

食谱

Luria Bertani（LB）肉汤
10克/升Bacto胰蛋白胨
5 g/L Bacto酵母提取物
10g/L NaCl
用120℃高压消毒灭菌20分钟
Luria Bertani盘子
LB培养基
15 g/L琼脂
用120℃高压消毒灭菌20分钟
M9（10x）
176.5g/L Na 2 HPO 4
30g/L KH PO 4
5克/升NaCl
10g/L NH 4 Cl
过滤灭菌
CaCl 2/MgSO 4溶液（100x）
0.01M CaCl 2
0.1M MgSO 4
通过使用0.22微米孔微孔过滤器过滤或在120℃下高压灭菌20分钟进行消毒
M9极限媒体
1x M9
1×CaCl 2/MgSO 4 溶液
1 mg/ml维生素B1（硫胺素）
0.5％鼠李糖通过高压灭菌消毒水并加入其余的无菌成分。不要对最终解决方案进行高压灭菌。该溶液可以保持在室温，但应保持光线不变，以维持硫胺素完整性
M9-鼠李糖板
M9极限媒体
15 g/L琼脂
通过在120℃高压灭菌20分钟灭菌含有琼脂的水，并加入其余的无菌成分。
磷酸盐缓冲液（PBS）
8克/升NaCl
0.2克/升KCl
2.89g/L Na 2 HPO 4/12H 2 O
0.2g/L KH 2 PO 4
将pH调节至7.4
10％无菌甘油
在MilliQ水中稀释甘油至10％（v/v）的最终浓度用120℃高压消毒灭菌20分钟
L-鼠李糖
为了制备无菌的鼠李糖溶液（我们建议制备15％的储备溶液），用MilliQ水稀释鼠李糖，并使用0.22μm孔的Millipore过滤器过滤

致谢

这项工作是在Díaz-Orejas教授和García-del Portillo教授的实验室进行的，由西班牙经济部拨款BFU2011-25939，CSD2008-00013和BIO2013-46281-P/BIO2015-69085-REDC支持和竞争力感谢亚历山德拉·威利斯对稿件的批判性评论该协议最初在Lobato-Márquez等人，2016中描述。

参考

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