材料和试剂

1,000μl无菌移液管尖端
1.5 ml无菌微量离心管
细胞过滤器，70μm（VWR，目录号：734-0003）
皮下注射针，27 G（Fine-Ject ^R）（VWR，目录号：613-2012）
8毫米一次性活检穿孔器（KAI，目录号：BP-80F）
精密注射器，1 ml（VWR，目录号：613-3908）
标准手术刀＃11（精细科学工具，目录号：10011-00）
4T1野生型细胞系从密歇根大学的F. Miller获得
SW480，早期结肠腺癌（Duke B期）细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）（LGC Standards）（ATCC，目录号：CCL-228）
SW480 + LOX细胞系来源于母系，之前已经描述过（Baker等人，2011; Baker等人，2013）
对于人类结肠直肠癌模型，使用8周龄的女性免疫缺陷型MF1裸鼠（Envigo [以前称为Harlan Laboratories Inc.]）
对于鼠乳腺癌模型，使用8周龄的雌性BALB/c小鼠（Taconic Biosciences）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31966047）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
无菌PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：20012068）}
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），苯酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
乙醇
生长培养基（见食谱）

设备

台式离心机能够容纳15毫升管子
移液器，P1000（Gilson）
细胞培养箱37℃，5％CO 2（HERAcell）
标准玻璃血细胞计数器
卡尺
不锈钢螺旋桨，一端扁平，一端弯头，6英寸（联合科学用品，型号：SSFB06）
标准图案手术剪刀钝/钝（Fine Science Tools，目录号：14000-18）
8毫米喷砂智能插拔上几何，图1A（箭头）（TA Instruments）
8毫米喷砂阶梯下几何形状，图1A（箭头）（TA仪器）
发现系列混合流变仪（TA仪器，型号：dhr-2）

程序

该协议描述了可以从各种来源获得的组织样本的生物力学询问。在这里，我们利用鼠乳腺癌的4T1/BALB/c同基因原位模型（Miller和Heppner，1979; Cox等人，2013; Cox等人， 2015），以及已经被设计为过表达基质交联酶赖氨酰氧化酶（LOX）的人结肠直肠癌的皮下SW480 /裸体模型（Baker等人，2011; Baker& et al。，2013）。已经显示原发性肿瘤中的高LOX表达可以交联细胞外基质成分，特别是胶原，导致组织的拉伸强度增加（Levental等人，2009; Baker等人[ al。，2011; Baker等人，2013）。可以从任何来源收集肿瘤组织，包括基因工程小鼠模型（GEMMS），癌症的自发模型，以及原位和皮下的癌症模型（见注1）。虽然我们用人类结肠直肠癌模型和鼠乳腺癌模型证明了这种方法，但是可以使用包括患者材料在内的任何实体肿瘤组织，提供符合以下标准的组织样本：
A.对于完整的手术切除，组织必须易于接近。
B.组织可立即进行新鲜处理（见注2-4）。
C.可以获得直径8 mm，厚度≥1 mm的最小活检尺寸。
D.可以立即测量样品（参见注释2-4）。

测量肿瘤组织的相对硬度
使用配备有8mm喷砂平行板上几何形状的TA Instruments DHR-2控制应变旋转流变仪和8mm喷砂下阶梯几何形状（图1A），对所有肿瘤样品进行流变学表征。下表1概述了使用Discovery Series混合流变仪（TA）测定肿瘤组织的最佳测试参数（TA仪器，型号：DHR-2）在所述条件下（见注释5-7）
表1.流变仪设置

参数	值
温度（°C）	21
温度浸泡时间（秒）	0
振荡频率（rad/sec）	1.0
振荡应变（％）	0.2-2.0
每十年数据点	15
受控应变型	连续振荡[直接应变]
轴向力（N）	0.03-0.05
调节时间（秒）	2.0
抽样时间（秒）	3.0

肿瘤植入
1. 将4T1和SW480细胞系在37℃和5％CO 2维持在DMEM/10％FBS/Pen-Strep中。
2. 从细胞吸出生长培养基，并用PBS短暂洗涤细胞。
3. 吸出PBS，并加入足以覆盖细胞的胰蛋白酶-EDTA（0.25％）。
4. 一旦细胞分离，以300×g离心5分钟，并重悬于正常生长培养基中并计数细胞。
5. 在PBS中洗涤细胞，然后通过细胞过滤器（70μm）去除细胞簇。
6. 用乙醇清洁和灭菌小鼠的接种面积。
7. 混合细胞并将细胞抽入注射器而不用针头。将27 G针放在注射器上，确保清除任何空气和气泡。
8. 将100μl肿瘤细胞注入感兴趣的解剖位置（见注8）
9. 在植入后，需要按照制度指南定期监测动物，并且每周测量三次肿瘤大小和体重（见注9）。
实验设置
1. 根据制造商的指导启动和校准流变仪。
2. 将步进的下几何形状连接到加热的珀耳帖板（图1A）（箭头）。
3. 连接8 mm直径的上几何（图1A）（箭头）。
4. 将珀尔帖温度设置为所需温度（表1）
5. 手术切除要测量的肿瘤组织（见注2，3，4和10）。图1B-1D显示植入后3周切除原发性原位脂肪垫植入的4T1乳腺癌肿瘤。当使用卡尺测量时，肿瘤测量大约520 mm 3，这足以允许收集8 mm直径的组织样本（参见上述程序下的条件）。
6. 从感兴趣区域切割≥1mm厚的部分用于测量（图1E和1F）。不用于流变学的剩余组织可用于进一步分析，包括RNA/DNA /蛋白质提取，或固定/冷冻，并进行免疫组织化学/免疫荧光（见附注11）。
7. 使用8毫米一次性活检穿孔器切割圆形活检，并移除外来材料（图1G）。
  
  图1.流变学设置 A. 8 mm喷砂下阶梯几何（箭头），peltier板和8 mm喷砂上部几何（箭头）; B.在BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫植入后3周的原发性原位4T1肿瘤（圆圈）; C和D.从脂肪垫（E和F）进行的死后手术切除整个肿瘤（箭头）。使用来自肿瘤中感兴趣区域的手术刀切割≥1mm的切片（参见注释2-4）。 G.使用8毫米一次性活检穿孔器，切割圆形活检，除去外来材料。然后将组织样品放置在下几何形状（箭头）上，并且上部几何形状（箭头）降低，使得其与样品接触。上部几何（箭头）和下几何形状（箭头）之间的间隙缓慢减小，直到达到稳定的轴向力（见表1）并开始测量。 I.与没有肿瘤的正常乳腺脂肪垫组织相比，在植入后3周从4T1乳腺癌肿瘤获得的测量的代表性实例。在十年的应变下测量储能模量为0.2至2％（左）。右图表示1％应变下的储能模量，表明肿瘤组织比健康对照组织显着更硬。 μ表示平均储能模量（G'）±标准偏差。 J.代表性的例子是如何过度表达赖氨酰氧化酶（LOX），一种有效的细胞外基质交联剂，导致人类结肠直肠癌模型中肿瘤组织刚度的增加。皮下植入后4周测量肿瘤组织的储存模量（G'）（左）。右图表示1％应变下的储能模量，说明LOX在肿瘤细胞中的过度表达导致其环境僵化。 μ表示平均储存模量（G'）±标准差。
8. 将流变仪上的轴向力置零。
9. 使用平头刮刀小心地将肿瘤组织转移到较低的几何形状（箭头）。
10. 向上移动8 mm的上几何（箭头），直到它接触到组织的顶部表面（图1H）
11. 将间隙减小50μm增加以增加施加到组织的轴向力，并持续到达到稳定的轴向力，如表1所示（见注7）。
12. 根据表1设置振荡应变扫描。
13. 根据表1设置振荡频率。
14. 开始测量。
相对刚度分析
1. 确保在评估的应变范围内的线性粘弹性响应[储能模量（G'）]（图1I和1J）（见注6和12）。
2. 当比较多个组织测量时（图1I和1J），在样品之间的匹配应变（示例为1％应变）下提取储能模量（G'）。
3. 如果需要，弹性模量（E）可以使用：
  从储能模量（G'）确定 E = 2×G'（1 +υ）
  其中，υ=大多数组织的泊松比为0.5。

数据分析

为了确保可靠的数据，请务必在每个实验组中进行至少5次生物学重复，并进行相应的控制。当比较多个组织测量时（图1I和1J，右图），为每个重复提取1％应变下的储能模量（G'）。确保在评估的应变范围内的线性粘弹性（储能模量[G']）响应（图1I和1J，左图）（见注5和6）。如果不是这种情况，不考虑测量。如果这是一个复发性问题，频率和应变将需要针对特定组织进行优化（见注5）。

笔记

所有动物实验均在丹麦动物实验检验局的授权和指导下进行
避免在测量前长时间（超过1小时），在缓冲液（如PBS）中储存组织和特别准备的活组织检查用于测量缓冲液，因为这可能导致组织肿胀和破坏影响机械性能。
不要让组织或准备好的活组织检查干燥，因为这会导致收缩，也会影响机械性能
在准备之前将整个组织储存在冰上。避免在测量前储存超过1小时。
对于极软或非常硬的样品，可能需要优化测量参数。可能需要确定最佳频率和应变参数，以确保在组织的线性粘弹性响应内收集测量结果。
储能模量（G'）从恒定（平稳）值偏离超过10％的点表示偏离线性粘弹性行为。
在开始测量之前向样品施加轴向力时，请确保测量结果一致。上述肿瘤组织的0.03-0.05N值是足够的
植入肿瘤细胞的数量取决于实验的设置。在8周龄的BALB/c小鼠的第4个乳腺脂肪垫中，将0.5×10 6个细胞重新悬浮于每只小鼠100μlPBS中。我们将1×10 6细胞重新悬浮在每只小鼠100μlPBS中，皮下注射到8周龄免疫缺陷型MF1裸鼠的侧腹。在两种模式下，通过道德准入的小鼠进行全身麻醉并不是必需的（见注1）。重要的是准备足够量的细胞重悬于PBS中以包括针的死体积（通常为100μl）。我们建议根据需要准备大约两倍。在收获细胞进行植入之前，细胞也积极生长（指数生长）也很重要
确保定期监测肿瘤植入后动物的健康状况（体重和呼吸）。可以使用卡尺来监测外部/表面肿瘤大小，不应超过制度指导。
肿瘤达到合适大小所需的时间将取决于所讨论的细胞系，并应在研究人员开始流变学实验之前进行优化。通常，植入后21-24天，乳腺癌的4T1-Balb/c同基因小鼠模型的直径将达到8-10毫米。结直肠癌的SW480 /裸体皮下模型大约需要25-40天的植入。收集样品时，请务必在无菌条件下进行手术切除。组织的直径应为最小8 mm，厚度最小为1 mm（见图1）。通常，2-4毫米的组织厚度是理想的
在流变学表征之后，组织可以用福尔马林或PFA固定，并用于常规组织病理学染色（如苏木精和细胞的伊红染色或胶原的Picrosirius红染色）。注意使用这些样品进行免疫组织化学，或蛋白质/DNA/RNA提取，因为流变学表征是新鲜的，并且可能导致测量过程中基因和蛋白质表达的变化。
组织通常在0.1至10弧度/秒（数据未显示）的范围内最低频率依赖，并且当使用DHR2时，组织优选为1弧度/秒的振荡频率。在这个频率下，肿瘤样品显示出在所评估的应变范围内的线性粘弹性响应（见图1I和1J）。

食谱

生长培养基
DMEM
胎牛血清（10％）
青霉素 - 链霉素（100U/ml）

致谢

该协议已经从先前发表的论文（Baker等人，2013; Cox等人，2013; Madsen等人， 2015年）。 TRC由澳大利亚NHMRC新研究者补助金支持。 CDM由瑞典所有的RagnarSöderberg基金会，BioCARE，Cancerfonden和ÅkeWiberg基金会提供支持。我们感谢哥本哈根大学生物技术研究创新中心Lena Wullkopf的协助，并感谢Janine Erler教授在生物技术研究与生物技术研究所哥德堡大学创新中心提供流变仪。

参考

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