材料和试剂

0.45μmMillex-HA注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHA033SS）
（Poly-prep色谱柱）（Bio-Rad Laboratories，目录号：7311550）
具有Ultracel-10膜的Amicon Ultra-15离心过滤器单元（用于Drp1结构域的10k过滤器）（EMD Millipore，目录号：UFC901024）
带有Ultracel-50膜的Amicon Ultra-15离心过滤器（50k全长Drp1过滤器）（EMD Millipore，目录号：UFC905024）
聚碳酸酯膜0.4μm（Avanti Polar Lipids，目录号：610007）
96孔分析板（Corning，目录号：3915）
挤压机配有支架/加热块（Avanti Polar Lipids，目录号：610000）
过滤器支持（Avanti Polar Lipids，目录号：610014）
2毫升琥珀色玻璃样品瓶（WHEATON，目录号：224981）
一次性培养管（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
50 Ulrta-Clear管（Beckman Coulter，目录号：344057）
Rosetta ^TM 2（DE3）pLysS感受态细胞（EMD Millipore，目录号：71403）
pET15b载体（EMD Millipore，Novagen）
50％Ni-NTA珠（EMD Millipore，目录号：70666）
4-20％Tris-HCl预制凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：3450034）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
乙醇（PHARMCO-AAPER，目录号：111000200）
DMSO（Fisher Scientific，目录号：S369-500）
液氮
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850457）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-（赖斯汀罗丹明B磺酰基）（罗丹明DPPE）（Avanti Polar Lipids，目录号：810158）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DPPE）（Avanti Polar Lipids，目录号：850705）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯（DPPA）（Avanti Polar Lipids，目录号：830855）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（DOPA）（Avanti Polar Lipids，目录号：840875）
1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸酯（Palmitoyl lysoPA）（Avanti Polar Lipids，目录号：857123）
1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸（Dihexanoyl PA）（Avanti Polar Lipids，目录号：830841）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850355）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850375）
1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DOPE）（Avanti Polar Lipids，目录号：850725）
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸 - （1'-外消旋甘油）（DPPG）（Avanti Polar Lipids，目录号：840455）
1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸 - （1'-外消旋甘油）（DOPG）（Avanti Polar Lipids，目录号：840475）
1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸（DPPS）（Avanti Polar Lipids，目录号：840037）
1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）（Avanti Polar Lipids，目录号：840035）
1'，3'-双[1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸] -sn-甘油（TOCL）（Avanti Polar Lipids，目录号：710335）
1'，3'-双[1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸] -sn-甘油TPCL（Echelon Biosciences，目录号：L-C160）
气氮
SilverQuest ^TM银染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：LC6070）}
Bacto ^TM胰蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271）
Bacto ^{TM酵母提取物（BD，Bacto ^{TM，目录号：212750）}}
琼脂（Alfa Aesar，目录号：J10906）
超纯水（例如，MilliQ）
氨苄青霉素钠盐（Alfa Aesar，目录号：J11259）
氯霉素（Mediatech，目录号：61-239-RI）
β-D-吡喃半乳糖苷，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（AMRESCO，目录号：0487）
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310-1）
氢氧化钾（KOH）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：3116-01）
氯化镁水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Avantor，Performance Materials，J.T.Baker，目录号：2444）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I0125或I202）
注意：产品"I0125"已停止
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4·H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S369-500）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S373-3）
氢氧化钠（NaOH）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：3722）
考马斯亮蓝R-250（AMRESCO，目录号：M128-50G）
乙酸（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412）
MES（2-吗啉代乙磺酸，一水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S5-3）
含有氨苄青霉素和氯霉素的LB板（参见食谱）
LB与氨苄青霉素和氯霉素（参见食谱）
0.5 M IPTG
0.5 M HEPES（pH 7.4）（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
10x PBS（参见食谱）
考马斯亮蓝溶液（见配方）
100mM MES（pH 7.0）（参见食谱）
20mM MES（pH 7.0）（参见食谱）
20mM MES（pH 7.0）/100mM NaCl（参见食谱）
2.7 M蔗糖/20 mM MES/100 mM NaCl（参见食谱）
1.25 M蔗糖/20 mM MES/100 mM NaCl（参见食谱）
0.25 M蔗糖/20 mM MES/100 mM NaCl（参见食谱）

设备

1 ml注射器（Hamilton，目录号：81365）
500μl注射器（Hamilton，目录号：81265）
100μl注射器（Hamilton，目录号：81065）
50μl注射器（Hamilton，目录号：80500）
25μl注射器（Hamilton，目录号：80400）
孵化器振荡器（37°C）（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Series 25）}
孵化器振荡器（16°C）（Lab Companion，型号：IS-971R）
1000毫升瓶（Beckman Coulter，目录号：A98814）
JLA8.1000转子（Beckman Coulter，目录号：969329）
GH3.8转子（Beckman Coulter，目录号：360581）
费雪科学声波分解器（Fisher Scientific，型号：100）
CS-6R离心机（Beckman Coulter，型号：CS-6R）
Avanti J-E（Beckman Coulter，型号：Avanti J-E，目录号：369001）
SpeedVac SVC100（Savant系统，型号：SpeedVac SVC100）
加热块（37℃，42℃，95℃）（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM Isotemp ^{TM数字和模拟干浴培养箱，目录号： 11-718）}
电动直立荧光显微镜（Olympus，型号：BX61）
POLARstar Omega（BMG LABTECH，型号：POLARstar Omega）
Labquake Shaker Rostisserie（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4152110）
SW55Ti转子（Beckman Coulter，目录号：342196）
Avanti J-26XP（Beckman Coulter，型号：Avanti ^® J-26 XP，目录号：393124）
Optima L-100XP超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^{TM，L-100XP，目录号：392050）}
Scanmaker 8700（Microtek，型号：Scanmaker 8700）
电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^TM HC）
多功能旋转器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2309）
涡旋混合器（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM模拟涡旋混合器，目录号：02215365）

软件

ImageJ（版本1.48， http://imagej.net/）

程序

蛋白质表达和纯化
1. 将携带Drp1的pET15b载体转化为Rosetta 2（DE3）pLysS感受态细胞。
2. 将细胞置于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上（参见食谱），并在37℃下孵育过夜。
3. 选择并将菌落放入补充有氨苄青霉素和氯霉素的10ml LB平板（参见食谱）中。在37℃，200rpm下摇动细菌培养过夜（New Brunswick Scientific，25系列）
4. 将5ml的培养物稀释成1L相同的生长培养基，并使用培养箱振荡器在200rpm下在37℃下继续培养培养3-5小时（New Brunswick Scientific，25系列）。
5. 将培养的细胞在冰上冷却，加入0.2ml 0.5M IPTG（参见食谱）至1L LB缓冲液。最终IPTG浓度为0.1mM
6. 使用冷藏培养箱振荡器（The Lab Companion，IS-971R）在200rpm下用冷却系统在16℃下振荡培养物。
7. 培养后，将培养基移至1000ml瓶（Beckman Coulter），并在4℃下在JLA8.1000转子（Avanti J-26XP）中以5,000×g离心15分钟。 />
8. 使用CS-6R离心机（Beckman Coulter）在GH3.8转子中以2,400×g离心分离15分钟，并在-80℃下冷冻细胞沉淀，用40ml PBS洗涤细菌两次。
9. 将冷冻的细胞沉淀重悬于40ml裂解缓冲液（参见食谱）。
10. 使用Fisher Scientific Sonic分解器模型100，将细菌在冰上超声处理10 x 5秒，然后设置5，然后在设置2下10 x 5秒。
11. 使用CS-6R离心机，在4℃下，在GH3.8转子中以2,400×g离心细胞匀浆15分钟。
12. 在JA-20X（Avanti J-E）中，在4℃，20,100xg离心上清液15分钟。
13. 将上清液通过孔径为0.45μm的Millex-HA注射器过滤器。
14. 使用Labquake Shaker Rostisserie在4℃下将裂解物与2ml预洗的50％Ni-NTA珠（His-Bind Resin，Novagen）孵育过夜。
15. 将样品置于15 mL柱（Poly-prep色谱柱，Bio-Rad Laboratories）中，在冷藏室中。
16. 用3ml裂解缓冲液洗涤珠子，然后用15ml裂解缓冲液洗涤
17. 用3ml洗涤缓冲液洗涤珠子（参见食谱），然后加入15ml洗涤缓冲液。
18. 使用0.9ml洗脱缓冲液（参见食谱）将3μl重组Drp1蛋白从柱中洗脱3次，并将洗脱液收集到9个300μl馏分中。
19. 使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定含有Drp1蛋白的级分。合并峰分数（通常为级分＃3和4）（图1），并与15ml不含咪唑的裂解缓冲液混合。
  
  图1.通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析纯化的Drp1
20. 将样品通过Amicon超离心过滤器（50k过滤器，全长Drp1和10k过滤器用于域），使用不含咪唑的裂解缓冲液三次。最终体积通常为1毫升。
21. 将样品与最终的20％DMSO混合，分装，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃。通常，全长Drp1的浓度为30μM
浮选分析
1. 除非另有说明，否则将脂质混合在POPC：罗丹明DPPE：可变脂质比为84：1：15（％mol）中。
2. 使用氮气将脂质干燥5分钟，并另外在SpeedVac中干燥过夜。
3. 在脂质膜中加入100μl/20μLMES（pH 7.0）/100 mM NaCl（见食谱）样品，旋转1 h。
4. 使用干冰和42℃的热块进行五次冻融循环。
5. 通过挤出通过孔径为400nm的纳米孔膜产生单层脂质体。该过程重复21次。
6. 确认使用荧光显微镜形成脂质体（图2）
  
  图2.脂质体的共焦荧光显微镜
7. 通过POLARstar Omega（波长; Ex 544nm，Em 590nm）检查罗丹明-PE的荧光强度，然后使用20mM MES（pH 7.0）/100mM NaCl，基于罗丹明强度调节脂质的浓度。 >
8. 将脂质体（5mM脂质）与His6-Drp1（5μM）（终体积：200μl）混合，并在4℃下使用Labquake Shaker Rostisserie在20℃温育下孵育1小时20分钟mM MES（pH 7.0）/100mM NaCl（图3）。
  
  图3. Drp1和脂质体通过蔗糖梯度离心进行培养和分析。量化与脂质体进入级分1和2的Drp1的量。
9. 在放置在管底部的最终1.73M蔗糖/20mM MES（pH 7.0）（终体积：1.25ml）中稀释Drp1-脂质体混合物。然后覆盖2.9ml 1.25M蔗糖/20mM MES（pH7.0）和0.85ml 0.25M蔗糖/20mM MES（pH7.0）（图3）。
10. 在SW55Ti转子（Beckman Coulter）中，在4℃下将蔗糖梯度在287,000×g离心2小时。
11. 从顶部收集五个级分（0.5，0.75，1.75，1.75和0.25 ml）。
12. 大多数脂质体通常漂浮在前两个级分。
13. 使用POLARstar Omega测量罗丹明强度。根据制造商的说明书，使用SDS-PAGE和银染（SilverQuest银染色试剂盒）分析各部分（等体积）。

数据分析

使用Scanmaker 8700扫描染色的凝胶，并使用NIH ImageJ量化条带强度。基于罗丹明-PE的荧光强度检测脂质体。规范Drp1和脂质体相对于各部分体积的量
对于统计分析，使用Student's t 测试来计算 P 值。

笔记

将样品装入SDS页面时，请用37℃的加热块加热样品。因为样品含有蔗糖，所以样品的流动性根据温度而变化。

食谱

LB板含氨苄青霉素和氯霉素
10克Bacto ^TM胰蛋白胨
10克NaCl
5克Bacto ^TM酵母提取物
15克琼脂
用超纯水加水至1升，121℃高压灭菌30分钟。高压灭菌后，让琼脂溶液冷却至55℃。加入最终100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素
LB与氨苄青霉素和氯霉素
10克Bacto ^TM胰蛋白胨
10克NaCl
5克Bacto ^TM酵母提取物
用超纯水加水至1升，121℃高压灭菌30分钟。高压灭菌后，将溶液冷却至55℃。加入最终100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素
0.5 M IPTG
1.19 g IPTG
用超纯水加满10毫升
0.5 M HEPES（pH 7.4）
238.4 g/L HEPES
用KOH调节pH至7.4，用超纯水将其填充至1升
裂解缓冲液（10mM咪唑，1mM MgCl 2，500mM NaCl，2mM 2-巯基乙醇，20mM HEPES，pH7.4）
40 ml/L 0.5 M HEPES（pH 7.4）
500 ml/L 1 M NaCl
1ml/L 1M MgCl 2
5 ml/L 2 M咪唑
140μl/L 2-巯基乙醇
用超纯水加满1升
洗涤缓冲液（40mM咪唑，1mM MgCl 2，500mM NaCl，2mM 2-巯基乙醇，20mM HEPES，pH7.4）
40 ml/L 0.5 M HEPES（pH 7.4）
500 ml/L 1 M NaCl
1ml/L 1M MgCl 2
20 ml/L 2 M咪唑
140μl/L 2-巯基乙醇
用超纯水加满1升
洗脱缓冲液（250mM咪唑，1mM MgCl 2，500mM NaCl，2mM 2-巯基乙醇，20mM HEPES，pH7.4）
40 ml/L 0.5 M HEPES（pH 7.4）
500 ml/L 1 M NaCl
1ml/L 1M MgCl 2
50ml/L 2M咪唑
140μl/L 2-巯基乙醇
用超纯水加满1升
10倍PBS（pH 7.4）
2.56g/L NaH 2 PO 4 H 2 O 2//O 2 22.5g/L Na 2 HPO 4·7H 2 O/
87.66克/升NaCl
用超纯水充满1升。用NaOH调节pH至7.0
考马斯亮蓝解决方案
2.5 g/L考马斯亮蓝R-250
100毫升/升酸性酸酸酯
450毫升/升甲醇 450 ml/L超纯水
100mM MES（pH 7.0）
21.538 g/L MES
3.068 g/L NaOH
用超纯水加满1升
20mM MES（pH 7.0）
200 ml/L 100 mM MES（pH 7.0）
用超纯水充满1升。用NaOH调节pH至7.0
20mM MES（pH7.0）/100mM NaCl 200 ml/L 100 mM MES（pH 7.0）
5.844克/升NaCl
140μl/L 2-巯基乙醇（最终2mM）
用超纯水充满1升。根据需要用NaOH将pH调节至7.0
2.7 M蔗糖/20 mM MES/100 mM NaCl 924.21克/升蔗糖
用20 mM MES/100 mM NaCl补充1 L
1.25 M蔗糖/20 mM MES/100 mM NaCl 427.875克/升蔗糖
用20 mM MES/100 mM NaCl补充1 L
0.25M蔗糖/20mM MES/100mM NaCl 85.575g/L蔗糖
用20 mM MES/100 mM NaCl补充1 L

致谢

感谢Iijima和Sesaki实验室的过去和现在的成员进行有益的讨论和技术援助。这项工作得到NIH授予M.I. （GM084015）和美国（GM089853）。

参考

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