材料和试剂

移液器提示：
（USA Scientific，目录号：1161-3800; 1161-1800和1161-1820）
用于补充（USA Scientific，目录号：1161-3700; 1161-1700和1161-1720）
Microfuge管（Fisher Scientific，目录号：02-681-320）
PCR管（Fisher Scientific，目录号：14-230-225）
用于菌落纯化/细菌再条纹的木棍（Ted Pella，目录号：1282）
圆底培养管（Fisher Scientific，目录号：14-956-6D）
冷冻小瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：368632）
冷冻瓶盖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：375930）}
硅胶旋转柱用于凝胶提取和质粒微量制备（Epoch Life Science，目录号：1920250）
培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
pPB41质粒（质粒和序列可得自 Genetic Stock Center根据要求; http://www.bgsc.org ）
pPB105质粒（质粒和序列可从 Genetic Stock Center获得; http://www.bgsc.org ）
TOP10大肠杆菌感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C404010）}
MC1061大肠杆菌感受态细胞（菌株编号PEB336，可根据要求提供）
Bsa 伴随10x Cutsmart缓冲液的I-HF（New England Biolabs，目录号：R3535L）
小牛肠碱性磷酸酶（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290L）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A451-4）
超纯蒸馏H 2 O（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977-15）}
T 4 DNA连接酶与伴随的10xT4连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202L）
T 多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491L）
PCR引物（由Integrated DNA Technologies合成）

引物扩增pPB41

oPEB217：5'-GAACCTCATTACGAATTCAGCATGC
oPEB218：5'-GAATGGCGATTTTCGTTCGTGAATAC

引物扩增CRISPR/Cas9

oPEB232：5'-GCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATG
oPEB234：
5'-GTATTCACGAACGAAAATCGCCATTCCTAGCAGCACGCCATAGTGACTG

引物序列CRISPR插入物
oPEB253：5'-GAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGA
编辑模板的序列5'的引物
oPEB227：5'-CCGTCAATTGTCTGATTCGTTA
示例上游编辑模板引物

oPEB237：
5'-GCATGCTGAATTCGTAATGAGGTTCAAAACGGCAGAGTATACAGAGGAG
oPEB238：5'-CCGGTTCCTTTTCCAGCGATGATTGACACTCTTGGATATCCG

示例下游编辑模板引物

oPEB239：5'-AAGAGTGTCAATCATCGCTGGAAAAGGAACCGGCGCTTTAAG
oPEB240：5'-GCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCtaggaagaagaatcatttcgaagc

MutS2中H743A突变的实例基因分型引物

oPEB262：5'-GGATATCCAAGAGTGTCAATCATCGCT

甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-4）
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
EDTA（Fisher Scientific，目录号：BP120-1）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
Tryptone（BD，Bacto ^TM，目录号：211699）
酵母提取物（BD，Bacto ^TM，目录号：212720）
氨苄青霉素（Fisher Scientific，目录号：BP1760-25）
壮观霉素（MP Biomedicals，目录号：0215206725）
氯霉素（Fisher Scientific，目录号：BP904-100）
琼脂（Acros Organics，目录号：400400050）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP1356-500）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E8751-25G）
硫氰酸胍（Fisher Scientific，目录号：BP221-1）
胍盐酸盐（Fisher Scientific，目录号：BP178-1）
乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G）
100mM dNTP组（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10297018）}
二硫苏糖醇（DTT）（Fisher Scientific，目录号：BP172-25）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ^{+ ^{）（Acros Organics，目录号：124530010）}}
T 外切核酸酶（New England Biolabs，目录号：M0363S）
Phusion DNA polymerase（New England Biolabs，目录号：M0530L）
DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0208L）
硫酸镁（MgSO 4）（Fisher Scientific，目录号：M65-500）
磷酸氢二钾（K 2）HPO 4（Fisher，目录号：BP363-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP362-1）
柠檬酸三钠脱水（C 6 H 5 Na 3 O 3·2H 2·2H 2/O）（Fisher Scientific，目录号：BP327-1）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1KG）
色氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP395-100）
苯丙氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP391-100）
氢氧化钾（KOH）（Fisher Scientific，目录号：P250-500）
柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
天门冬氨酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：A6558）
PEG-8000（Dot Scientific，目录号：DSP48080-500）
50x TAE（见配方）
1x TAE（见食谱）
LB媒体（见配方）
LB琼脂平板（参见食谱）
100毫克/毫升氨苄青霉素（见配方）
100毫克/毫升壮观霉素原料（见食谱）
5毫克/毫升氯霉素原料（见食谱）
70％（v/v）乙醇（参见食谱）
1％琼脂糖凝胶（参见食谱）
QG缓冲区（见配方）
PB缓冲（见配方）
Tris HCl，pH 7.5（参见食谱）
PE缓冲区（见配方）
10x退火缓冲液（见配方）
5x等温反应缓冲液（Gibson，2011）（见配方）
2x吉布森大师组合（Gibson，2011）（见食谱）
1 M MgSO 4（参见食谱）
LM培养基（LB培养基+ 3mM MgSO 4）（参见食谱）
10x PC缓冲（见配方）
MD媒体（见配方）
0.1 N KOH（参见食谱）
100毫克/毫升色氨酸储备（见食谱）
100毫克/毫升苯丙氨酸（见配方）
2.2毫克/毫升柠檬酸铁铵储备（见食谱）
100毫克/毫升天门冬氨酸钾股票（见食谱）

设备

孵化器（Napco，型号：320）
干热块（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM Isotemp ^{TM数字干浴/块加热器，目录号：11-718-2）}
移液器（Eppendorf，目录号：022575442）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
热循环仪（Eppendorf，型号：6325）
电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell GT卧式电泳系统，目录号：1704406）
电泳用电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^TM基本电源，目录号：1645050）
滚筒（Eppendorf，New Brunswick，型号：TC-7）
Milli-Q H 2 O分配器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Barnstead ^TM GenPure ^TM Pro，目录号：50131950）}
微波（Panasonic，目录号：NNS954WFR）
高压灭菌器

软件

在线工具Primer3（Koressaar和Remm，2007; Untergasser等人，2012）
Oligocalc（Kibbe，2007）

程序

构建含有用于靶向B的间隔物的质粒。枯草芽孢杆菌基因组
1. 准备用限制性内切核酸酶Bsa消化的pPB41（图1）
  组装50μl限制性消化反应：1x Cutsmart缓冲液（NEB），2μlBsa I-HF（20,000U/ml; NEB）和5μgpPB41。在培养箱中37℃孵育3至6小时。加入1μl小牛肠道磷酸酶（CIP; 10,000 U/ml; NEB），37℃孵育1 h。在1×TAE缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳（参见食谱），然后凝胶提取消化的质粒。
  注意：
  1. 通常使用质粒pPB41，但是我们还产生了一种衍生物pPB105，其中壮观霉素抗性盒被氯霉素抗性盒替代（参见图1）。程序的所有步骤对于pPB105是相同的，除了使用含有100μg/ml氨苄青霉素或20μg/ml氯霉素的LB琼脂平板（选择氯霉素，但是菌落生长较慢）来选择大肠杆菌克隆，并且枯草芽孢杆菌转化体使用含有5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板选择。//em>
  2. 凝胶提取通过从两个50μlPCR反应中从琼脂糖凝胶中切出合适的DNA条带并置于微量离心管中进行。通过加入350μlQG缓冲液（参见食谱）并在65℃下在加热块中温育来溶解凝胶切片。凝胶切片完全溶解后，加入200μl异丙醇并通过移液混合。将整个凝胶提取物加载到硅胶柱上。通过离心（室温下12,000×g，1分钟）收集流出物并丢弃。将柱洗涤并首先用500μlPB缓冲液（参见食谱），然后用750μlPE缓冲液（参见食谱）丢弃。如上所述通过离心干燥柱。通过如上所述的离心将DNA从柱中以75μl超纯H 2 O洗脱。
    
    图1.用Bsa I-HF 消化pPB41或pPB105
2. 准备磷酸化原间隔（图2）
3. Ligate proto-spacer和pPB41并分离新质粒（图3）组装20μl连接反应：1×T 4 DNA连接酶缓冲液（NEB），40至100ng pPB41（在前一步骤中用Bsa I-HF消化和CIP），25 nM原间隔（在前一步骤中退火并磷酸化），1μlT 4 DNA连接酶（400,000U/ml NEB）。让反应在室温下静置2-3小时。使用10μl连接反应来转化100μl化学感受态的TOP10大肠杆菌。可以使用含有100μg/ml氨苄青霉素或100μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板（参见食谱）来选择克隆。通过使用oPEB253的Sanger测序验证克隆。
  注意：其中原间隔物连接到pPB41中的第一克隆步骤不需要某种大肠杆菌菌株。我们使用TOP10细胞作为我们的一般克隆株。
  
  图3.磷酸化原间隔蛋白和pPB41的连接以产生"靶向质粒"
编辑质粒的构建

PCR扩增pPB41线性化（图4A）
使用Q5 DNA聚合酶（NEB）和引物oPEB217和oPEB218通过PCR扩增pPB41。在1×TAE缓冲液（参见食谱）中进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶提取。 PCR产物储存在-20°C直到使用。
注意：

用于该步骤的模板可以是pPB41或在步骤B1中产生的含有间隔区的质粒。

用于线性化pPB41的PCR程序是：

图4.编辑质粒的构建。 A.PPB41 PCR扩增子的示意图; B.CRISPR/Cas9 PCR扩增子的示意图; C.编辑模板PCR扩增子的上游和下游部分的示意图; D.Gibson使用A-C的PCR产物编辑质粒的大会。

PCR使用在步骤B1（图4B）中生成的质粒
扩增CRISPR/Cas9 使用Q5 DNA聚合酶（NEB）和引物oPEB232和oPEB234通过PCR扩增步骤B1中产生的质粒（本实施例中为pPB43）。在1×TAE缓冲液（参见食谱）中进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶提取。 PCR产物储存在-20°C直到使用。
注意：用于扩增CRISPR/Cas9的PCR程序与上述步骤B1中使用的相同。

PCR扩增编辑模板（图4C）
使用Q5 DNA聚合酶（NEB）通过PCR分别扩增编辑模板的上游和下游部分（本实施例中使用的引物分别用于上游和下游部分是oPEB237/oPEB238和oPEB239/oPEB240）。引物是使用在线工具Primer3（Koressaar和Remm，2007; Untergasser等人，2012）和Oligocalc（Kibbe，2007）设计的。编辑模板特异性引物与pPB41突变（上游正向引物起始5'-GCATGCTGAATTCGTAATGAGGTTC，接着是编辑模板特异性序列;下游反向引物开始5'-GCATAACCAAGCCTATGCCTACAGC，随后编辑模板特异性序列）将允许将编辑模板并入编辑质粒。编辑模板设计为大约2千碱基，其上游和下游部分由每个约1kb组成。编辑模板设计的关键方面是确保引导的Cas9在引入所需的突变后不能再靶向基因组。对于缺失，可以去除间隔物和PAM位点的整个序列。对于点突变，它更复杂。江泽民等人。（2013）发现，突变PAM位点或间隔区的前几个碱基是最优的（Jiang等人，2013）。编辑模板中心的重叠应该在模板的每一部分上有25个碱基（结果是总共有50bp重叠）。 PCR后，在1×TAE缓冲液（参见食谱）中进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶提取。 PCR产物储存在-20°C直到使用。
注意：

使用在线工具Primer3设计编辑模板引物（Koressaar和Remm，2007; Untergasser等，2012）。从编辑模板的中心选择大约250 bp的bp，并使用默认参数生成引物列表，但以下情况除外：1）引物尺寸为最小值：22，选择：24，最大值：28; 2）底漆GC％min：35; 3）最大自我互补性：6.0;和4）最大3'自身互补性：2.0。然后选择引物并使用第二个在线工具Oligocalc（Kibbe，2007）进行交叉检验。目的是确保潜在的发夹形成，3'互补性和自退火均不能使用该程序检测到。

在图中示例中使用的编辑模板为3 kb（每个编辑模板的上游和下游部分约为1.5 kb），但我们通常使用2 kb。我们还提供使用约2 kb的编辑模板制作的四种不同的基因缺失。

用于放大编辑模板的每个部分的PCR程序是：

使用Gibson Assembly（Gibson，2011）构建编辑质粒（图4D）
组装10μl吉布森装配反应：1次吉布森主混合物（参见食谱），40-100ng来自上述的线性化pPB41，40-100ng含上述间隔物的CRISPR/Cas9 PCR产物和20-40ng编辑模板。在50℃下在热循环仪中孵育反应90分钟。使用5μlGibson装配反应转化80μl化学有效的E。大肠杆菌菌株MC1061。可以像步骤A3那样选择克隆。使用引物oPEB253，oPEB227和编辑模板特异性引物对克隆进行测序。
注意：

使用recA +的克隆菌株是绝对关键的，因为天然感受态枯草芽孢杆菌的转化使用多聚体的质粒更为有效。我们用于质粒繁殖的大肠杆菌菌株是MC1061。我们在MC1061获得某些编辑质粒时也遇到困难，原因不明确。在这些情况下，我们将吉布森装配反应扩大到总体积20μl，我们使用20μl转化枯草芽孢杆菌，如方法C.该方法的效率较低，一些壮观霉素敏感的分离株保留野生型，类型基因型，因此通常至少筛选12个分离株。

使用oPEB227（pPB41的5'末端的序列）对编辑模板进行测序。在编辑模板中设计其他引物，以验证剩余序列。
编辑B的基因组。 subtilis

转换B。枯草芽孢杆菌与前一步骤获得的编辑质粒

准备自然胜任的枯草芽孢杆菌培养物（Burby and Simmons，2017）（图5A）使用木棒将培养板在30℃或37℃孵育的LB琼脂平板上的冷冻的20％甘油基质上分离出菌株过夜。

早晨，在14ml一次性圆底培养管中接种2ml LM培养基（参见食谱）。在37℃下在培养箱中的滚筒上培养培养物，直到OD 600在0.8和1.5之间（约2小时生长）。

将20μl的LM培养物转移到0.5ml预热的MD培养基中（参见Recipes）。在滚筒上37℃下培养MD培养4至6小时。

加入编辑质粒DNA（约200至600ng），并在37℃下在滚筒上孵育60至90分钟。通过在含有100μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板上电镀200μl来选择转化体，并在30℃温育过夜。
注意：

我们已经在MD媒体上找到了5小时，工作得很好，并且最常用，但是在一小时之内或之后添加DNA也是成功的。

在DNA加入后90分钟电镀非常好，但60分钟的电镀也将产生转化体

通过菌落纯化转化体（图5B）
建立几个分离株（6-12）

殖民地纯化是指为单个殖民地连续三至四次重建隔离的殖民地。

将来自前述步骤的单个菌落在含有100μg/ml壮观霉素的单个菌落的LB琼脂平板上重新条纹，并在30℃下在培养箱中孵育过夜。

固定质粒分离株（图5C）
将来自前述步骤的单个菌落重新置于单个菌落的LB琼脂平板上，并在42-45℃温育过夜。
注意：我们的孵化器设置为45°C，但成功使用了42°C。

图5. B中基因组编辑程序的概要。 subtilis （摘自图S2 [Burby and Simmons，2017]）。 A.第一步是转换B。枯草芽孢杆菌与编辑质粒。插入显示野生型mutS2 轨迹。 B.使用菌落纯化建立分离株后，分离物固化编辑质粒。插图描述使用质粒上的编辑模板进行同源性定向修复。 C.最后一步是验证编辑质粒和基因型分离株的损失，以验证突变是否成功引入。插入显示编辑的mutS2 轨迹。

筛选分离物用于质粒损失
将来自前面步骤的单个菌落重新划分到含有100μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板上，然后在LB琼脂平板上重新分成单个菌落。将板在45℃下在培养箱中孵育过夜。如果分离物丢失了质粒，则在具有壮观霉素的LB琼脂平板上不会生长

预期突变筛选（图6）
在含有壮观霉素的平板上不能生长的分离物进一步筛选出所需的突变的存在。在点突变的情况下，可以将引物设计为在点突变处退火（图6A），或者可以使用编辑模板外的引物扩增遗传基因座，如删除（见下文），随后是Sanger测序以验证点突变是否存在，并且不引入其他突变。在基因缺失的情况下，使用在基因组DNA内退火重组模板之外的PCR引物进行PCR扩增遗传基因座（图6B）。相对于来自野生型基因座的产物，PCR产物的迁移将更快

图6.基于基因组编辑的基于PCR的验证。 A.显示了B组中使用的PCR引物的位置的示意图; B.使用扩增PCR产物的溴化乙锭染色琼脂糖凝胶，使用特异于点突变的引物（H743A，我们改变了CAC→GCT）和B。（左图），并使用特异于编辑质粒的引物（右图）。筛选的12个分离株全部被发现具有预测点突变，其中2个保守对壮观霉素（星号）的抵抗。 PY79泳道中的缓慢迁移带对应于野生型背景中的非特异性PCR扩增。编码质粒在壮观霉素抗性分离物中可检测到，但在其余十个中不能检测到。 C.琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色PCR反应，使用特异性缺失四个B的引物。枯草芽孢杆菌基因。引物设计在编辑模板之外，因此特异于染色体DNA。对于所有四个缺失，发现所有分离株都是壮观霉素敏感的，每个缺失的三个分离株的PCR基因分型发现所有测试的分离株具有预期的缺失。注意，对于ponA的对照反应，PCR产物是微弱的，因为扩增子约为5kb，PCR的延伸时间为3分钟，这接近Q5 DNA完全延伸的极限聚合酶其他三个对照扩增子不大于3.4kb

保存冻结库存的新菌株
将确认具有预期突变的至少两个分离株的分离的LB培养物生长至约1至1.5的OD 600。通过在冷冻小瓶中加入甘油至最终浓度为20％来节省冷冻原料。将一个冷冻小瓶盖加入盖子并贴上标签。将冷冻小瓶直接放入-80℃的冷冻箱中

数据分析

有两个步骤需要数据分析来构建突变菌株。第一个是使用抗生素敏感性测定编辑质粒的损失，第二个是使用PCR基因分型来测定用于预期突变的遗传基因座。为了确定分离物是否已被修饰的编辑质粒，将6至12个分离株在含有和不含有100μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板上划线并生长过夜（参见方案的步骤C4）。在含有壮观霉素的LB琼脂平板上不生长的分离物已经被修复了编辑质粒。通过PCR进一步对已经固化的质粒的分离物进行基因分型。 PCR基因分型的数据分析将取决于正在引入的编辑类型。对于缺失，遗传基因座的PCR扩增将导致迁移的产物比野生型基因座的迁移快，导致PCR产物在琼脂糖凝胶上显现较低。对于插入，PCR产物将迁移比琼脂糖凝胶上的野生型产物慢。对于点突变，PCR产物的大小将不会改变。因此，必须使用突变特异性引物或Sanger测序来确认正确的基因型。对于突变特异性引物（参见图6B），PCR产物将存在或不存在。如果存在PCR产物，则表明存在突变。如果使用Sanger测序，将检测突变的序列，而不是野生型序列。

食谱

50倍TAE
242克Tris碱
57.1毫升冰醋酸
100ml EDTA，pH 8.0
将Milli-Q H 2 O加入1L
在室温下存放
1x TAE
20 ml 50x TAE
980ml Milli-Q H 2 O O
在室温下存放
LB媒体
10克NaCl
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
将Milli-Q H 2 O添加到总体积为1L的
高压釜灭菌
LB琼脂板
1 L LB媒体
18克琼脂
高压釜灭菌
允许冷却至约60℃;如果需要抗生素，那么现在就加入它们加入壮观霉素至终浓度为100μg/ml 加氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml 加入氯霉素至终浓度为20μg/ml。大肠杆菌，B组为5μg/ml。 subtilis
倒盘
100毫克/毫升氨苄青霉素库存
1克氨苄青霉素
加入Milli-Q水至10 ml 过滤灭菌
等分并储存于-20°C
100毫克/毫升壮观霉素库存
1g壮观霉素
加入Milli-Q水至10 ml 过滤灭菌
等分并储存于-20°C
5毫克/毫升氯霉素库存
50毫克氯霉素
加入70％（v/v）乙醇至10 ml
过滤灭菌
储存于-20°C
70％（v/v）乙醇 70毫升乙醇
30毫升Milli-Q H 2 O O
在室温下存放
1％琼脂糖凝胶 1克琼脂糖 100 ml 1x TAE
微波溶解琼脂糖的热溶液
加入溴化乙锭至终浓度为0.2μg/ml 倾斜凝胶
QG缓冲区
5.5 M硫氰酸胍
20mM Tris HCl，pH6.6
PB缓冲区
5 M盐酸胍
30％（v/v）异丙醇
Tris HCl，pH 7.5
通过将Tris碱溶解在Milli-Q H 2 O中并使用HCl将pH调节至7.5来制备Tris HCl
PE缓冲区
10mM Tris HCl，pH7.5
80％（v/v）乙醇
10x退火缓冲液
100mM Tris HCl，pH7.5
1 M NaCl
1mM EDTA，pH 8.0
超纯H 2 O O
过滤灭菌
5x等温反应缓冲液（Gibson，2011）
0.5M Tris HCl，pH7.5
25％（w/v）PEG-8000
50mM MgCl 2
50 mM DTT
每个dNTPs 1 mM 5mM NAD ⁺
储存于-20°C
2x吉布森大师组合（Gibson，2011）
320μl5x等温反应缓冲液
0.64μlT 5外切核酸酶（10,000U/ml）
20μlPhusion DNA聚合酶（2,000 U/ml）
160μlTaq DNA连接酶（40,000U/ml）
储存于-20°C
1 M MgSO 4
120.37g MgSO 4（F.W.120.37g）
将Milli-Q H 2 O加入1L
高压釜灭菌
在室温下存放
LM培养基（LB培养基+ 3mM MgSO 4）
2 ml LB培养基 6μl1 M MgSO 4
10x PC缓冲区
10.7g K 2 HPO 4
6g KH 2 PO 4
1.18g柠檬酸三钠脱水（C 6 H 5 Na 3 O 3·2H 2·2H 2 O） sub> O）
将Milli-Q H 2 O加入到100 ml
中过滤灭菌
在室温下存放
MD媒体
1x PC缓冲区
2％（w/v）葡萄糖
50μg/ml色氨酸
50μg/ml苯丙氨酸 11μg/ml柠檬酸铁铵// 2.5mg/ml天冬氨酸钾
3mM MgSO 4
过滤灭菌
商店防止光线在4°C
0.1 N KOH
56.1mg KOH（F.W.56.11g）
将Milli-Q H 2 O 2加入到10ml
中为每次使用准备新鲜
100毫克/毫升色氨酸库存
1克色氨酸
加入0.1N KOH至10ml（准备新鲜）
过滤灭菌
商店防止光线在4°C
100毫克/毫升苯丙氨酸股票
1g苯丙氨酸
加入0.1N KOH至10ml（准备新鲜）
过滤灭菌
商店防止光线在4°C
2.2毫克/毫升柠檬酸铁铵矿物质
110毫克柠檬酸铁铵
将Milli-Q H 2 O加入到50ml的
中过滤灭菌
商店防止光线在4°C
100毫克/毫升天门冬氨酸钾股票
5g天冬氨酸钾
将Milli-Q H 2 O加入到50ml的
中过滤灭菌
储存于4°C

致谢

这项工作得到NIH授权R01 GM107312对L.A.S.的支持。和国家科学基金会#DGE 1256260至P.E.B.的博士后研究金。

参考文献

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