材料和试剂

一般材料和试剂
1. 吸管提示
2. 人微血管内皮细胞（HMEC-1）（ATCC，目录号：CRL-3243）
3. 培养基200（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：M-200-500）}
4. 10％胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone ^{TM，目录号：SH30071.03HI）}
5. 浓度为100U/ml的青霉素 - 链霉素溶液（Caisson Laboratories，目录号：PSL01-100ML）
6. 内皮细胞生长培养基（参见食谱）
用于transwell渗透性测定的材料和试剂
1. Corning 6.5 mm Transwell刀片，带有0.4μm聚碳酸酯膜的24孔板（Corning，目录号：3413）
2. 96孔板（透明聚苯乙烯孔，平底）（ExtraGene，目录号：EL-1190-F）
3. 链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶（HRP）（R& D Systems，目录号：DY998）
4. 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物（Sigma-Aldrich，目录号：T0440）
5. 停止溶液（2 N H 2 SO 4水溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：30743）
RTCA的材料和试剂
1. 96孔E板（ACEA BIO，目录号：05232368001）

设备

镊子
一般设备：37℃的细胞培养箱，供应5％CO 2 气氛
透孔渗透性测定法：VersaMax酶标仪（Molecular Devices，VersaMax ELISA Microplate Reader）
RTCA：xCELLigence RTCA系统（ACEA BIO，型号：xCELLigence RTCA SP系统，目录号：00380601030）

软件

GraphPad Prism软件

程序

透孔渗透性测定法
1. 在每个6.5mm transwell插入物膜上的300μl内皮生长培养基中生长2×10 5个HMEC-1细胞（图1）。
  
  图1. transwell渗透性测定的示意图概述程序和典型结果
2. 向24孔板中加入1ml内皮生长培养基
3. 使用镊子将介质用介质转移到孔中，然后用盖子盖住板。镊子的灭菌是不必要的，尽管用80％乙醇处理是推荐的。
4. 将板在37℃的培养箱中孵育两天。
5. 从顶部和底部腔室吸出培养基，然后用如上所述的相同体积的新鲜培养基200培养基替换。
  注意：此步骤中的每一个运动都应该仔细而缓慢地进行，以免激活内皮细胞。吸头不应接触膜。用新鲜的介质以液体方式填充室以避免剪切流动。
6. 将板放回37°C的孵化器两天。
7. 用镊子将插入物移入空井，等待5分钟观察上腔室介质是否泄漏到下腔室。如果没有泄漏，请继续下一步。如果有泄漏重复步骤A6-A7，并等待细胞汇合。内皮细胞必须完全融合，以确保细胞细胞连接的形成和良好的内皮屏障。通常，孵育5天后，细胞形成汇合单层。
8. 重复步骤A5，并将所需的刺激添加到顶部腔室中的培养基。刺激可以是细胞因子（TNF-α），诱导炎症反应的分子（脂多糖，组胺）或重组蛋白（凝血酶，登革热病毒非结构蛋白1）。
9. 在37℃的培养箱中孵育平板所需的时间。当细胞在10分钟至24小时之间被刺激时，该测定最有效。这里我们显示用凝血酶刺激内皮细胞30分钟的结果（图1）
10. 在测量内皮单层的渗透性之前，制备含有链霉抗生物素蛋白-HRP的培养基（每1ml无血清培养基为15μl链霉抗生物素蛋白-HRP）。
11. 在顶部腔室中吸入培养基，并用含链霉亲和素-HRP的培养基补充它们。
  注意：如步骤A6所述，每次运动都应该温和谨慎，移液管吸头不要接触膜。
12. 在一个新的24孔板的每个孔中加入1毫升无血清培养基。然后将插入物放入。
13. 覆盖板，并将板放在37℃的培养箱中。
14. 孵育5分钟后，除去插入物，将来自下室的20μl培养基转移到新的96孔板中。每一个条件都应该一式三份。
15. 在96孔板的每个孔中加入50μlTMB底物，并在室温下等待5分钟使反应稳定。孵育后，TMB底物应变蓝。如果颜色没有变化，请延长孵化时间。但是，孵化时间不应超过20分钟
16. 在每个孔中加入25μl终止溶液，并用ELISA读数器获得450nm的吸收。
  示意图概要程序和典型结果如图1所示。
RTCA
1. 在96孔E板的每个孔中生长1×10 4个HMEC-1细胞，并用100μl内皮生长培养基填充孔。
2. 将板放在xCELLigence RTCA系统中，该系统设置在37℃的孵化器中。
3. 设置程序以每小时检测电阻，并监测细胞何时增长到融合。一般来说，孵化2天后，细胞生长至融合，因此建议在孵育36小时后检查细胞指数曲线。
4. 细胞指数曲线稳定后，刷新培养基，再等待2小时，使细胞指数曲线再次稳定
5. 将所需的刺激物添加到每个孔中。每一个条件都应该一式三份。
6. 将板放回37℃培养箱中的xCELLigence RTCA系统。
7. 设置所需的检测周期和时间间隔，并开始录制。
  RTCA的典型结果如图2所示
  
  图2.由RTCA检测到的凝血酶诱导的内皮通透性增加

数据分析

对于transwell渗透性测定，所得到的吸收强度值应该通过控制（例如，时间零，载体对照）进行归一化。以确定相对渗透率。每个实验应重复3次以上，然后可以使用GraphPad Prism软件和相关统计方案进行统计。在这里，我们显示了使用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较检验作为检验后的结果（图1）。
对于RTCA，每个时间点的细胞指数应在零时间内归一化以确定相对细胞指数。计算平均细胞指数并绘制时间。

笔记

其他类型的内皮细胞，如HUVECs或hCMEC/D3也可以用于任一种测定;然而，可能需要用诸如纤连蛋白，胶原，明胶和/或层粘连蛋白之类的底物预涂膜或板以促进细胞粘附。
内皮单层的完整性对于任一方法的准确度至关重要，因此处理细胞时应始终避免剪切流动。对于RTCA，由于96孔E板的电极非常脆弱和敏感，因此应始终小心处理。吸管尖端不应接触板上的电极，从而避免内皮单层的任何破坏。手也不应该接触板下面的电极，因为它可能会破坏电阻的检测。胰蛋白酶消化和洗涤后，E板可以重复使用（Stefanowicz-Hajduk等人，2016）。 E板可以重复使用至少3次，而不影响先前文献和我们的经验中的数据再现性（Stefanowicz-Hajduk等人，2016）。
使用前运行预测试程序。如果在检测电阻中显示错误，则E板不适合进一步测定。

食谱

内皮细胞生长培养基
补充有10％胎牛血清（FBS）和青霉素 - 链霉素溶液的培养基200，终浓度为100U/ml

致谢

本研究得到台湾科技部（102-2320-B-006-025-MY3）（105-2321-B-006-023）和NCKU传染病与信号研究中心的资助，台南，台湾）。该协议是由Chuang等人发表的那些修改。（2011）和宝钢等人。（2013年）。

参考

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Bischoff，I.，Hornburger，MC，Mayer，BA，Beyerle，A.，Wegener，J.and Furst，R。（2016）。评估微血管内皮屏障功能的缺陷：基于阻抗的装置与经典的大分子示踪剂测定。 > 6：23671.
Chen，HR，Chuang，YC，Lin，YS，Liu，HS，Liu，CC，Perng，GC和Yeh，TM（2016）。登革热病毒非结构蛋白1通过巨噬细胞迁移抑制因子和自噬诱导血管渗漏。 PLoS Negl Trop Dis 10（7）：e0004828。
（2011）。登革热病毒感染引起的巨噬细胞迁移抑制因子增加血管通透性。细胞因子 54（2）：222-231。 br />
Komarova，Y。和Malik，AB（2010）。通过旁分泌细胞和跨细胞转运途径调节内皮细胞通透性。 Annu Rev Physiol 72：463-493。
Stefanowicz-Hajduk，J.，Adamska，A.，Bartoszewski，R.and Ochocka，JR（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih。 gov/pubmed/27625205"target ="_ blank">在xCELLigence实时细胞分析仪中重复使用E板细胞传感器阵列。生物技术 61（3）：117-122。