材料和试剂

移液器提示（TipOne过滤器技巧，STARLAB INTERNATIONAL）
10厘米盘
管（Eppendorf安全锁微量离心管）（Eppendorf，目录号：0030120086）
细胞刮刀（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL0010）
注射器
Whatman论文（Whatman，目录号：10547922）
塑料包装
清洁剃刀刀片
不间断小鼠超声成纤维细胞系NIH/3T3（ATCC，目录号：CRL-1658）
甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
0.2M乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），用NaOH调节pH至8.0（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA），用NaOH调节pH至8.0（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v）（Carl Roth，目录号：A156.1）
乙酸钠（pH 5.2）
70％乙醇
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）
Quick Blunting Kit（New England Biolabs，目录号：E1210L）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
对于感兴趣的核小体区域特异的PCR引物。对于小鼠rDNA启动子，我们使用mrDNA（-63/-36）：GATCACAAGCATAAAAGAGACAGGGAGG
QIAquick核苷酸去除试剂盒（QIAGEN，目录号：28306）
[300℃/mmol，10mCi/ml]（PerkinElmer，目录号：BLU002001MC）
Go Taq G2 Hot-Start Green PCR Master Mix（Promega，目录号：M742A）
接头引物：接头S：5'-gaattcagatc-3'，接头L：5'-gcggtgacccgggagatctgaattc-3'
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
1 M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）用NaOH调节pH至7.9（应用目录号：A1069）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4·3H 2 O）（Carl Roth，目录号：6878.1）
氯化镁（MgCl 2·6H 2 O）（应用目录号：131396.1211）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：499609）
L-α-溶血磷脂酰胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：L4129）
微球菌核酸酶（MNase）（New England Biolabs，目录号：M0247S）
三碱基
硼酸
甲酰胺
二甲苯cyanol
溴酚蓝
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：74255）
Rotiphorese测序凝胶浓缩物（Carl Roth，目录号：3043.1）
Rotiphorese测序凝胶稀释剂（Carl Roth，目录号：3047.1）
过硫酸铵（APS）（Carl Roth，目录号：9592.2）
TEMED（Carl Roth，目录号：2367.3）
渗透缓冲液（见配方）
MNase消化缓冲液（参见食谱）
TE缓冲（见配方）
10x TBE缓冲区（见配方）
甲酰胺加载缓冲液（参见食谱）
变性聚丙烯酰胺凝胶（6％）（见配方）

设备

移液器
标准微量离心机
NanoDrop 2000 UV-Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific ^{TM，型号：NanoDrop 2000）}
PCR机器
带电源的电泳设备
真空泵
凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：583）
注意：本产品已停产。
荧光成像仪（FujiFilm，型号：FLA-3000）
成像板（GE Healthcare，型号：BAS-IP MS 2025 E）

软件

量化软件（Raytest，AIDA Image Analyzer）

程序

从细胞中纯化单核细胞DNA
1. 通过在室温下向10ml培养基（1％甲醛终浓度）中加入270μl37％甲醛溶液10分钟，将NIH/3T3细胞固定在10cm皿（80％汇合点）上10分钟。通过加入1/20体积的2.5M甘氨酸溶液（125mM甘氨酸最终）5分钟来淬灭过量的甲醛。
2. 用PBS洗两次后，在培养皿的透化缓冲液中，37℃下将细胞透化1分钟。
3. 去除透化缓冲液，并在室温下直接将细胞在MNase消化缓冲液中孵育20分钟。通过加入EDTA和EGTA终止浓度为10mM的MNase。弃去溶液，并通过刮擦收集PBS中的细胞并将其转移到微量离心管中
4. 通过加热还原甲醛介导的交联，在含有300mM NaCl的PBS中在65℃孵育细胞6小时。将DNA溶液与相同体积的苯酚：氯仿：异戊基溶液混合，并在标准微量离心机（13,523×g，室温）下旋转5分钟。将上层水相转移到新鲜管中并重复萃取。向DNA溶液中加入1/10体积的3M乙酸钠（pH 5.2）和2.5体积乙醇，并在-20℃下沉淀DNA 30分钟。在标准微量离心机（13,523×g，4℃）中将沉淀物旋转15分钟，小心地除去上清液，并用70％乙醇洗涤一次。空气干燥沉淀并溶于50μlTE缓冲液中
5. 为了分离单核细胞大小的片段，在2％琼脂糖凝胶上分离DNA。从凝胶上清除〜150bp的条带，并根据制造商的说明书用QIAquick Gel Extraction Kit纯化DNA。在30-50μl洗脱缓冲液中洗脱。
6. 测量NanoDrop 2000分光光度计上的DNA浓度，并保存在-20°C。来自NIH/3T3细胞10cm的单核细胞体DNA的产量在4-8μg之间。
连接到单核细胞DNA的接头
1. 为了产生钝化和磷酸化的DNA末端，使用Quick Blunting Kit如下所述设置反应。在室温下孵育30分钟，然后在70℃酶灭10分钟
  
  10x钝化缓冲区
  2.5μl
  
  1 mM dNTP
  2.5μl
  
  酶混合物
  0.5μl
  
  DNA
  2.0μg
  
  H ₂ O
  至25μl
2. 在TE缓冲液中稀释接头S和L，最终浓度为20μM（质量浓度为〜0.3μg/μl）。退火S和L通过以下程序在PCR机上：
  95℃，15分钟
  65℃，15分钟（斜率0.01℃/秒）
  55℃，15分钟（斜率0.01℃/秒）
  45℃，15分钟（斜率0.01℃/秒）
  37℃，15分钟（斜率0.01℃/秒）
  25℃，15分钟（斜率0.01℃/秒）
  4℃，5分钟
3. 为了将双链接头L + S（来自步骤B2）连接到单核细胞体DNA（来自步骤B1），如下所述设置反应，并将反应在16℃温育过夜。在65℃灭菌20分钟酶，用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA，并在20μlTE缓冲液中洗脱。
  
  10x连接缓冲液
  2μl
  
  100 mM ATP
  1μl
  
  T4 DNA连接酶
  1μl
  
  DNA（来自步骤B1）
  1μg
  
  链接器L + S（来自步骤B2）
  1μg
  
  H ₂ O到
  20μl
LM-PCR
1. 通过设置下面的反应并在37℃下孵育1小时，对放射性核素体区域特异性PCR引物进行标记。在65℃下灭活PNK 20分钟后，用QIAquick Nucleotide Removal Kit纯化引物，并在20μlTE缓冲液中洗脱。
  
  10x PNK缓冲区
  2μl
  
  PNK
  3μl
  
  [γ-³² P] -ATP（3.3μM）
  9μl
  
  引物（20μM）
  1μl
  
  H ₂ O
  8μl
2. 设置含有接头连接的单核细胞DNA（来自步骤B3），接头引物L和^{32标记的特异性引物（来自步骤C1）的LM-PCR反应如下：
  Go Taq PCR Master Mix
  7.5μl
  
  DNA（来自步骤B3）
  2μl
  
  链接器L（10μM）
  0.5μl
  
  ³² P引物（来自步骤C1）
  2μl
  
  DMSO
  0.5μl
  
  H ₂ O
  2.5μl}
3. 运行以下"Touchdown"PCR程序：
  变性94℃5分钟
  94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒; x 3个周期
  94℃30秒，64℃30秒，72℃30秒; x 3个周期
  94℃30秒，63℃30秒，72℃30秒; x 3个周期
  94℃30秒，62℃30秒，72℃30秒; x 3个周期
  94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒; x 3个周期
  94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒; x 15个周期
  完成扩展72°C 10分钟
凝胶电泳
1. 准备6％变性尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶（参见食谱）
2. 组装电泳并在250℃下预先在1×TBE中预处理凝胶30分钟。预运行允许凝胶/缓冲系统平衡，并将凝胶加热至45-55℃的工作温度。
3. 预运行后，使用注射器用新鲜缓冲液冲洗冲洗凝胶袋。
4. 将等体积的甲酰胺加载缓冲液加入到LM-PCR反应（来自步骤C3）中，并在95℃下孵育5分钟，然后在冰上快速冷却。该步骤应在凝胶预运行期间进行，以使LM-PCR /加载缓冲液混合物在冰上同时冲洗凝胶袋。因此，预运行和样品加载之间的时间被最小化以避免冷却加载5μl的LM-PCR /加载缓冲液混合物。重新开始电泳并运行1.5-2小时。
5. 拆卸凝胶装置，将凝胶放在Whatman纸上，用塑料包装盖住相对的凝胶面。凝胶的哪一边面朝下都没关系。然而，夹住凝胶的一个上角以确定干燥后的位置是有帮助的。
6. 在80℃下真空干燥凝胶1-2小时
7. 在磷光体成像板上暴露凝胶过夜
8. 使用荧光成像仪扫描屏幕，并使用适当的软件（例如，AIDA Image Analyzer）量化表示不同核小体位置的条带。

数据分析

检测来自代表不同核小体位置的LM-PCR产物的放射性信号可进行相对的半定量分析。用适当的软件量化信号强度，并将它们在一个样品/泳道内相互关联。例如，对于rDNA启动子，NucU和NucD 两个核小体构型，我们使用NucU/NucD 比来比较不同的生理条件（Zhao等，，2016a和2016b）。使用核小体位置的内部比例进行比较而不是比较样本之间的相同位置减少了处理样品之间变化的影响，从而提供了更强大的结果。通过重复LM-PCR至少两次（技术重复）和通过使用单独制备的核小体DNA样品（生物重复）至少三次进行整个程序来验证数据的重复性。此外，在LM-PCR中使用不同的基因特异性引物也是验证结果的好方法。如果比较两个不同处理的细胞样本之间的核小体位置的内部比例，则使用配对的双尾Student's t检验来计算统计学显着性。

食谱

渗透缓冲液
150 mM蔗糖
80 mM KCl
35 mM HEPES（pH 7.4）
5mM K 2 HPO 4
5mM MgCl 2
0.5mM CaCl 2
0.05％L-α-溶血磷脂酰胆碱
MNase消化缓冲液
150 mM蔗糖
50 mM NaCl
50mM Tris-HCl（pH7.4）
2mM CaCl 2
50 U/ml MNase
TE缓冲区
20mM Tris-HCl（pH8.0）
2 mM EDTA
10x TBE缓冲区（1 L）
108克Tris碱
55克硼酸
40ml的0.5M EDTA（pH8.0）
甲酰胺加载缓冲液
95％甲酰胺
0.025％二甲苯氰胺
0.025％溴酚蓝
18 mM EDTA
0.025％SDS
变性聚丙烯酰胺凝胶（6％）

致谢

我们感谢Ingrid Grummt对手稿的意见。这项工作由图林根国家计划（图尔根研究部（TMWWDG），德意志集团1036），"细胞网络（2014年EcTop调查报告）"和巴登的图林根国家计划ProExzellenz（RegenerAging-FSU-I-03/14） - 符腾堡州基金会。
该协议从以前的工作（Li等人，2006; Zhao等人，2016a和2016b）进行了改编。

参考

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Li，J.，Langst，G。和Grummt，I.（2006）。 NoRC依赖的核小体定位沉默rRNA基因。 EMBO J 25（24）：5735-5741。
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