材料和试剂

A2和A72 J-Lat细胞培养
1. 75厘米组织培养瓶（Corning，Falcon ^{，目录号：353110）}
2. 提示
  0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：02-681-440）
  1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-707-502）
  101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-707-509）}
3. A2和A72 J-Lat细胞（Jordan等人，2003）
4. RPMI（Mediatech，目录号：10-040-CV）
5. 胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
6. L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：25-005-Cl）
7. 100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活
1. 96孔V底组织培养板和盖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：N249570和N163320）}
2. 提示
  0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：02-681-440）
  1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-707-502）
  101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：02-707-509）}
3. RPMI（Mediatech，目录号：10-040-CV）
4. 胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
5. L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：25-005-Cl）
6. 100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
7. TNFα（PeproTech，目录号：300-01A）
8. JQ1（Cayman Chemical，目录号：11187）
9. Prostratin（Sigma-Aldrich，目录号：P0077）
10. 苯甲酰苯胺异羟肟酸（SAHA）（Sigma-Aldrich，目录号：SML0061）
11. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
12. 1x PBS（Mediatech，目录号：21-031-CV）
13. MACSQuant运行缓冲区（Miltenyi Biotech，目录号：130-092-747）
14. ApoTox-Glo ^TM Triplex Assay（Promega，目录号：G6320）
15. RPMI培养基（见食谱）
16. TNFα储备溶液（参见食谱）
17. JQ1库存解决方案（见配方）
18. Prostratin储备溶液（参见食谱）
19. 苯乙酰苯胺异羟肟酸（SAHA）储备溶液（见配方）

设备

移液器
生物安全柜2级
CO 2组织培养培养箱（Thermo Electron，型号：Forma< sup> Steri-Cult<> CO 2培养箱，目录号码：3307）
用于96孔板的台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-14R）
MACSQuant VYB FACS分析仪（Miltenyi Biotech，型号：MACSOuant ^® VYB，目录号：130-096-116）
SpectraMax MiniMax ^{TM 300成像细胞仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax MiniMax 300）}

软件

FlowJo 9.9或永不（Tree Star）

程序

A2和A72 J-Lat悬浮细胞培养
1. 将A2和A72细胞在40ml培养基中的75cm 2组织培养瓶中的RPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）中培养。将烧瓶水平放置以增加细胞生长的表面积。
2. 细胞每1-2天分裂一次，并应保持浓度为2×10 5/ml〜1.5×10 -6/ml。
3. 药物治疗前一天将A2或A72细胞分裂至5×10 5/ml。
通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活
1. 计数单元格并用新介质调整单元格编号。将约2×10 5个/孔的A2或A72细胞铺在96孔组织培养板中的195μlRPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）。每个条件执行三次重复。
2. 用0.016-10ng/mlTNFα，100nM-1μMJQ1,100nM-2.5μMProstratin，330nM-2.5μMSAHA，DMSO对照刺激细胞，或未处理。如果用TNFα处理，使用PBS或水作为对照，取决于用作稀释剂。所有药物和对照物以5μl的量移液，达到200μl/孔的总体积。通过上下移动将细胞和药物混合至少3次。
3. 在CO 2培养箱中37℃培养18-48小时。
4. 从培养箱取板，并在室温下以1341 x g（2,400 rpm）（台式离心机，Beckman）离心2分钟。
5. 然后直接进行流式细胞分析。细胞不必被洗涤或固定。
  注意：
6. 根据制造商的说明书，使用SpectraMax MiniMax TM/300多成像细胞仪（图1），用ApoTox-Glo Triplex Assay（Promega）测量活力，细胞毒性和细胞凋亡。 />
  
  图1.药物治疗细胞的活力，细胞毒性和细胞凋亡的测量。在药物处理的A72 J-Lat细胞中进行ApoTox-GloTM Triplex测定（Promega）。 A.细胞毒性和活力; B.细胞凋亡;所有测量重复至少三次，平均显示三次技术重复（±SD）。

数据分析

通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活（图2）

首先，在活的J-Lat细胞上设置门。通过正向（FSC区域）和侧向散射（SSC-Area）分析（图2A）监测细胞活力。

单刀闸（FSC-Height vs. FSC-Area）（图2B）

在SSC-Area和GFP/FITC-Area上设置门，以识别GFP ⁺单元格的数量（图2C）。

每个样品通常一式三份分析，实验用来自至少3次独立实验的细胞进行（图3）。通过计算（GFP ⁺细胞实验1 + GFP ⁺细胞实验2 + GFP ⁺细胞实验3）/3来平均三个重复。还计算误差条的标准偏差（STDEV）。

图2.通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活分析A2或A72 J-Lat细胞的门控策略：A.基于大小（FSC区域）对活J-Lat细胞门控）和粒度（SSC-Area）; B.单闸门（FSC-Height vs. FSC-Area）; C.Gate on GFP ⁺ J-Lat细胞（SSC-Area vs.GFP-FITC-Area）。

图3.流式细胞术检测HIV-1 LTR转录激活。用TNFα处理18小时的典型结果，使用A2 J-Lat细胞剂量依赖性反应。显示来自三个重复（±SD）的GFP ⁺细胞百分比的平均值。

食谱

RPMI媒体
RPMI补充了，
10％FBS
1％L-谷氨酰胺
1％青霉素/链霉素
储存于4°C
TNFα储备液
100 ng /μl，无菌水储存于-80°C
JQ1库存解决方案
10mM在DMSO中储存于-80°C
注意：避免反复冻融！
Prostratin储备溶液
5毫升无菌水
储存于-20°C
苯甲酰苯胺异羟肟酸（SAHA）储备溶液
10mM在DMSO中储存于-20°C

致谢

我们感谢Marielle Cavrois和流式细胞术核心为流式细胞术提供的服务。加利福尼亚大学旧金山Gladstone病毒学研究所的帮助下，本出版物成为可能。艾滋病研究免疫中心（CFAR），NIH资助计划（P30 AI027763）。这项研究得到了amfAR艾滋病毒治疗研究所的一部分的支持，该研究所获得了来自amfAR拨款109301的资助。此外，我们非常感谢加州艾滋病研究项目（F13-GI-316）获得DB支持，并向CARE协作机构（U19 AI096113）和NIH（RO1 AI083139和RO1 DA043142）授予MO支持该协议改编自以前的工作："BET溴结构域靶向化合物通过Tat独立机制从延迟重新激活HIV"（Boehm等人，2013）。

参考

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