材料和试剂

培养皿60 x 15毫米（SARSTEDT，目录号：82.1194.500）
15毫升圆锥管
磨砂显微镜载玻片（尺寸：1×3";厚度：1-2mm）（UltiDent Scientific，目录号：170-7107A）
显微镜盖玻璃（尺寸：22×22＃1.5）（Fisher Scientific，目录号：12-541B）
铂金线（Thomas Scientific，目录号：1233S71）
巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
电子。大肠杆菌细菌HT115 ^DE3与质粒pL4440-空载体
电子。具有质粒pL4440-oct-1（Ahringer's系列）的大肠杆菌细菌HT115 ^DE3。序列验证了
电子。具有质粒pL4440-oct-2（Ahringer's系列）的大肠杆菌细菌HT115 ^DE3。序列验证了
布里斯托尔N2（野生型）和RB1084 [Oct] 1（ok1051 ）I]来自Caenorhabditis 遗传中心
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Bio Basic，目录号：PB0445）
硫酸镁（MgSO 4）（Bio Basic，目录号：MRB0329）
氯化钙二水合物（CaCl 2）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8503）
乙醇100％（任何公司的作品）
多柔比星（来自HôpitalMaisonneuve-Rosemont，Montreal，Canada的研究）。库存浓度为2 mg/ml
IPTG（Bio Basic，目录号：PRB0447）
盐酸左旋咪唑（MP Biomedical，目录号：155228）
透明的指甲油，来自美洲马的Wild Shine
用于Luria Broth（LB）培养基的Tryptone（Bio Basic，目录号：TG217（G211））
酵母提取物（Wisent Bioproducts，目录号：800-150-LG）用于LB培养基
氯化钠（NaCl）（Wisent Bioproducts，目录号：600-082）
细菌性琼脂（Wisent Bioproducts，目录号：800-010-CG）
线虫生长培养基（NGM）的胨（Wisent Bioproducts，目录号：800-157-LG）
琼脂糖（Wisent Bioproducts，目录号：800-015-CG）
氢氧化钠（NaOH）（Bio Basic，目录号：SB0617）
Bleach Lavo Pro6（Lavo Inc，Montreal，Canada）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Bio Basic，目录号：S0404）
LB溶液（参见食谱）
线虫生长培养基（NGM）（见食谱）
琼脂垫（见食谱）
碱性次氯酸盐溶液用于漂白蠕虫（见食谱）
M9缓冲区（见配方）

设备

孵化器在20°C，但范围为15至37°C（SHEL LAB，型号：2020）
37℃孵化器（Panasonic Healthcare，型号：Mir-262）
37°C振动筛（Inforst，型号：Multitron Standard）
500毫升玻璃瓶（Wheaton带有内衬帽的刻度玻璃介质瓶）
微波（变频器型号，松下医疗）
55°C水浴（Precision Scientific，目录号：66800）
金属铲（VWR）
火焰
中性培养管16 x 15 mm
Pyrex锥形瓶不同大小的细菌培养
高压灭菌器
立体显微镜Leica MZ 8（Leica 10445538计划显微镜物镜1.0x）（Leica，型号：MZ 8）
DeltaVision精英恢复系统（GE Healthcare，型号：DeltaVision Elite High Resolution Microscope）和 DeltaVision成像系统用户手册
Fisher Vortex Genie 2（Fisher Scientific，目录号：12-812）
Eppendorf 5810 R离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
VWR摇摆摇摆机基础（VWR）
Ptc-100可编程热控制器96孔（Bio-Rad实验室，型号：Ptc-100 可编程热控制器）
离心机（Sigma离心机，型号：Sigma 1-14）

软件

ImageJ成像软件
SoftWorx软件

程序

用于蠕虫生长的细菌和培养基的制备
1. 细菌制备（食管）
2. ℃。线虫生长培养基制备
  1. 使用微波（功率2级25分钟）将玻璃瓶（500毫升）中的固体NGM熔化25分钟。
  2. 将熔融的介质保持在55℃，水浴15-20分钟
  3. 使用前，添加：
    12.5ml 1M KH 2 PO 4 pH 6
    500微升1M MgSO 4
    500μl1M CaCl 2
    500μl胆固醇（在95％乙醇中储存5mg/ml）
    如果使用携带L4440载体或靶基因的敲低细菌菌株HT115 ^DE3，则将500μl氨苄青霉素（储备100mg/ml）。
  4. 轻轻倒转瓶子几次以混合所有成分，然后将6ml培养基倒入60 x 15 mm培养皿中。
  5. 让它在室温下干燥约1小时
  6. 一旦干燥，使用灭菌的细菌电镀棒扩散上述步骤A1中制备的70μl细菌以形成草坪。细菌的光密度OD 600小于1.0。或者，细菌可以3滴分散在板上。
  7. 在37℃孵育板过夜。
3. 蠕虫生长
蠕虫同步
1. 预计4个板将填充成虫，通过立体显微镜可视化，此时可以进行同步。获得大量蠕虫的另一种方法是在液体培养基（不含琼脂的NGM培养基）中培养它们。
2. 向每个板中加入2ml碱性次氯酸盐溶液（漂白溶液），并通过在无菌的15ml锥形管中移液（每片约10秒）快速收集蠕虫。用蠕虫菌株的名称日期并标记管。或者，用1ml M9缓冲液收获蠕虫，并将其收集到15ml锥形管中。离心机在Eppendorf 5810 R离心机中，使用带有适配器的旋转叶轮转子（A-4-81），在4°C下用1740 x g的15 ml锥形管连接2分钟。弃去M9缓冲液，加入2ml漂白溶液。以这种方式，蠕虫被洗涤一次。
3. 迅速开始涡旋7分钟，在漩涡上设置8，并检查立体显微镜下成年蠕虫是否裂解，只有鸡蛋存在。
  
  注意：步骤B2和B3必须小心进行，因为它们对蛋孵化至关重要。
4. 没有任何延迟，将离心机放在Eppendorf 5810 R离心机中，在4℃下以1,740×g离心2分钟。
5. 吸出上清液，但留下约1ml的溶液。
6. 加入5ml M9缓冲液，重复离心和抽吸，如步骤B4和B5。
7. 重复4次以上步骤B6，以便去除任何痕量的漂白溶液。
8. 在最终的1ml M9缓冲液中孵育蛋在20℃过夜。在这段时间里，鸡蛋会孵出并产生L1阶段的蠕虫
蠕虫治疗
1. 细菌制备
  1. 在3种不同的管中，加入10ml LB培养基和10μl氨苄青霉素（100mg/ml）
  2. 在1 ^st管中，添加一些殖民地的E。大肠杆菌 HT115 ^DE3 /空载体L4440。
  3. 在2 ^nd管中，添加一些殖民地的E。大肠杆菌 HT115 ^DE3/pL4440-oct-1。
  4. 在3 ^rd管中，添加一些殖民地的E。大肠杆菌 HT115 ^DE3/pL4440-oct-2。
  5. 将所有管子在37°C的轨道振荡器中孵育5小时。
2. 药片制备
  1. 融化一瓶如上所述的500ml固体NGM（参见上文的生长培养基制备）。
  2. 对于正常的药物盘 - 没有击倒
    1. 将保持在55℃的30ml熔融的NGM培养基转移到小的无菌瓶中。这将产生3个培养皿（60 x 15毫米），每个培养皿含有〜10ml的NGM培养基，用于一式三份测定。
    2. 将多柔比星（库存2 mg/ml）添加到每6 ml NGM培养基的期望最终浓度，倒入60 x 15 mm培养皿。对于多柔比星使用0.1至100μM取决于菌株。观察到吸收低至0.5μM的多柔比星。
      重要：不要忘记准备没有药物的药片。
    3. 在室温下放置板至少15分钟使培养基固化。
    4. 加入70μlE。大肠杆菌HT115 ^DE3/pL4440-空载体细菌。
    5. 在37℃孵育板过夜。
  3. 用于击倒药片
3. 现在所有的板都准备好添加50μl的L1同步蠕虫。
4. 验证在立体显微镜下板上是否有近50个L1级蠕虫。
5. 将板在20℃下孵育3天
显微镜可视化
1. 准备幻灯片
  1. 在磨砂的显微镜载玻片上加入一滴（约50μl）的3％琼脂糖，并用另一个载玻片挤压形成三明治。 10秒后，取出一张幻灯片，露出琼脂糖。
  2. 使用可编程热控制器96孔，在65°C约15-30分钟时用琼脂糖干燥载玻片。
2. 安装蠕虫
  1. 将7μl1 M左旋咪唑加入到载玻片上干燥琼脂的表面上
  2. 在每张幻灯片中，通过使用铂丝来传播蠕虫，从单一治疗条件中添加10-15只年轻成年蠕虫。
  3. 在将下一个10-15个蠕虫从不同的治疗条件转移到新的载玻片上之前，用火焰灭菌铂金线。
  4. 加上盖玻片，用清漆指甲油将玻璃盖和盖玻片密封。
3. 显微镜可视化
  包含蠕虫的幻灯片已准备好可视化。将载玻片放置在落射荧光显微镜的台上。
  1 ^st调整目标
  2 ^nd选择过滤器并调整所有必要的参数
  3 ^rd一切准备就绪，开始捕获图像
  4 ^th保存图像
  以下是使用DeltaVision显微镜可视化蠕虫的详细说明。
  1. 将一滴DeltaVision浸入油1.534添加到幻灯片上，以便使用40x目标。
  2. 将安装的幻灯片倒置在显微镜上。
  3. 将目镜滤光片调整到POL滤镜。
  4. 打开SoftWorx软件。见GE Healthcare手册（GE Healthcare，2014）。
  5. 按显微镜。
    将打开3个窗口（图1）。
    
    图1. SoftWorx桌面显示。 Resolve3D窗口包括采集参数和用于移动舞台的控件，"数据收集"窗口将显示图像，并且"过滤器监视器"显示当前选择的过滤器。 />
  6. 在名为Resolve3D的窗口上（图1）。
  7. 按下齿轮（设定）打开Resolve3D设置窗口（图2）。
    
    图2. Resolve3D窗口设置
  8. 在Resolve3D窗口（图1）中，设置图4中的以下参数。
    
    图4.设置参数
    1. 激励：POL。
    2. 排放：POL。
    3. ％T：32％。
    4. 曝光：0.025。
    5. 镜头：40x。
  9. 按Erlenmeyer。
  10. 将打开一个名为"设计/运行实验"窗口的窗口（图5）。
    
    图5.设计并运行实验窗口
4. 结果分析

数据分析

结果代表了一个实验的单个蠕虫，其中10个蠕虫被放置在载玻片上（图8）。用相同的数据重复实验3次。从咽后的荧光是从肠中检测到的自发荧光（图8）。使用ImageJ根据Papaluca和Ramotar（2016）量化数据。

图8.对于导致OCT-2上调的 oct-1 的N2野生型动物中的多柔比星摄取。 之前，我们显示下调刺激了Oct-2的表达，这促使药物摄入到C。 elegans （Papaluca和Ramotar，2016）。未经处理缺乏多柔比星是由缺乏黄色荧光所证明的，绿色背景是由动物摄取食物的自发荧光。 B.用多柔比星处理（1μM）。由于绿色自发荧光和来自药物的红色荧光的合并，多柔比星摄取可见黄色。圈子显示咽的位置。刻度棒=50μm。有关详细信息，请参阅数据分析。

笔记

我们通常使用细菌的新鲜培养而不是使用冷冻细菌作为蠕虫食物。
始终在无菌条件下工作。在手表上的真菌（白色到黑色像蜘蛛网），很少蘑菇（棕色斑点）。如果是这种情况，最好的解决方案是漂白蠕虫，并为新幼虫收集鸡蛋。

食谱

LB解决方案
5克胰蛋白胨
2.5克酵母提取物
5克NaCl
ddH <2> O至500 ml
加入7.5g琼脂，如果制成固体培养基板
线虫生长培养基（NGM）
1.25克蛋白胨
1.5克NaCl
8.75克琼脂
ddH <2> O至500 ml
高压灭菌器
当介质介于50至55°C之间时，在浇注板之前添加以下组分：
12.5ml 1M KH 2 PO 4 pH 6
500微升1M MgSO 4
500μl1M CaCl 2
500μl胆固醇（在95％乙醇中储存5mg/ml）
如果使用含有细菌的细菌，HT115 ^DE3
，将500μl氨苄青霉素（储备100mg/ml）
琼脂垫
3％琼脂糖在MIIIiQ水中需要时融化
碱性次氯酸盐溶液（漂白溶液）（每月新鲜）
8.25毫升ddH 2 O -/- 3.75 ml 1N NaOH 3.00 ml漂白剂（Javel）
M9缓冲区（1 L）
6g Na 2 HPO 4
3g KH 2 PO 4
5克NaCl
0.25g MgSO 4·7H 2 O→// 通过高压消毒灭菌

致谢

这项工作由D.R.的研究资助（RGPIN/202432-2012）资助。来自加拿大自然科学与工程研究理事会。以前描述了该协议的简要版本（Papaluca和Ramotar，2016）。

参考

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