材料和试剂

提示（BM设备，目录号：BMT-10G和BMT-200; Corning，目录号：4846）
一次性移液器（Greiner Bio One International，目录号：606160和607160）
微量离心管（Greiner Bio One International，目录号：616201）
滤纸（GE Healthcare，目录号：3030-6461）
聚偏氟乙烯（PVDF）膜（EMD Millipore，目录号：IPVH00010）
Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
牛血清白蛋白（BSA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-23294）
λ蛋白磷酸酶（λPPase）（New England Biolabs，目录号：P0753）
小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）（Takara Bio，目录号：2250）
（II）氯化四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：136-15301）
溴酚蓝（BPB）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
Marker III（Wako Pure Chemical Industries，目录号：230-02461）
抗IRF5抗体（Abcam，目录号：ab21689）
MaxBlot solution 1（MEDICAL& BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：8455-100）
辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体（GE Healthcare，目录号：NA934）
ECL Prime（GE Healthcare，目录号：RPN2236）
Immunostar LD（和光纯药公司，目录号：292-69903）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
Na 2 HPO 4·12H 2 O（和光纯药工业公司，目录号：196-02835）
氯化钾（KCl）（和光纯药，目录号：163-03545）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（和光纯药，目录号：169-04245）
NP-40（Nacalai Tesque，目录号：25223-75）
脱氧胆酸钠（Nacalai Tesque，目录号：10712-12）
SDS（Nacalai Tesque，目录号：08933-05）
完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche Diagnostics，目录号：11836170001）
PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾酒片（Roche Diagnostics，目录号：04906837001）
甘油（Nacalai Tesque，目录号：17018-25）
2-巯基乙醇（和光纯药，目录号：131-14572）
吐温20（Nacalai Tesque，目录号：28353-85）
脱脂牛奶（Morinaga Milk Industry）
丙烯酰胺（Nacalai Tesque，目录号：00809-85）
N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（双）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：138-06032）
磷标记丙烯酰胺（和光纯药，目录号：AAL-107）
APS（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-08021）
TEMED（和光纯药，目录号：205-06313）
甘氨酸（Nacalai Tesque，目录号：17109-35）
Tris（Nacalai Tesque，目录号：35406-91）
MOPS（Dojindo，目录号：343-01805）
亚硫酸氢钠（Nacalai Tesque，目录号：31219-55）
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-01827）
EDTA.2Na（Dojindo，目录号：345-01865）
7.5％Phos标签预制凝胶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-17381）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）（参见食谱）
不含EDTA的裂解缓冲液（参见食谱）
1％NP-40 TBS缓冲液（见配方）
6x样品缓冲液（见配方）
含有吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水（见食谱）
阻塞解决方案（见配方）
手工磷标签丙烯酰胺凝胶（见配方）

分离（下）凝胶
堆叠（上）凝胶

Tris-甘氨酸运行缓冲液（参见食谱）
Tris-MOPS运行缓冲区（见配方）
转移缓冲区（见配方）

设备

冷藏式微型离心机（TOMY SEIKO，型号：KITMAN-24）
595 nm波长的微孔板阅读器（Tecan，型号：F039300REMOTER）
热块（主要科学，型号：MD-02N）
电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645070）
凝胶罐（NIHON EIDO，型号：NA-1012）
水平摇床（YAMATO SCIENTIFIC，型号：MK200D）
半干式吸墨纸（NIHON EIDO，型号：NA-1512）
印刷辊（Bio-Rad Laboratories，目录号：1651279）
发光图像分析仪（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000 mini）

程序

细胞裂解物制备
1. 通过离心（300×g，5分钟，4℃）收获1-5×10 6细胞。
  注意：IRF5磷酸化发生在特定的细胞类型和条件下。例如：用CpG-B寡脱氧核苷酸（ODN）刺激的骨髓衍生的树突状细胞（BMDC）（Ban等，2016）。通过用100ng/ml Flt3配体培养小鼠骨髓细胞获得BMDC。培养9天后，收集BMDC，并在6孔培养板中以5×10 6个细胞/孔接种。然后用0.15μMCpG-B ODN刺激3或6h（图2）。适当的细胞模型的其他实例包括用IRF5和MyD88（Ban等人，2016）转染的HEK293T细胞或IRF5和IKKβ（Lopez-Pelaez等人，2014; Ren等人，2014），THP-1细胞用脂多糖（LPS）（Ren等人，2014）和用CL097刺激的Gen2.2细胞（Lopez-Pelaez等人，2014）。
2. 去除上清液，点击管子松开细胞沉淀，加入5ml冰冷的PBS，并将细胞倒置5次混合细胞。
3. 离心分离细胞。
4. 取出上清液，快速离心样品，小心地取出所有残留的上清液，不会干扰细胞沉淀
5. 向细胞沉淀加入50μl冰冷的无EDTA的裂解缓冲液，然后上下冲洗20次。
  注意：EDTA可以通过螯合金属离子来阻止Phos-标记与靶蛋白磷酸基团的结合;因此，裂解缓冲液应不含EDTA。
  （可选）为了验证检测到的磷酸化的磷酸酶处理，使用1％的NP-40 TBS缓冲液代替无EDTA的裂解缓冲液。
6. 将管放在冰上30分钟。
7. 将样品以15,000×g离心在4℃离心15分钟，然后将上清液（细胞裂解物）转移到冰上的干净的微量离心管中，而不会在底部转移细胞碎片。
  注意：细胞裂解物可以储存在-80°C。
SDS-PAGE
1. （可选）如果您准备手工制作的Phos标签丙烯酰胺凝胶，而不是使用预制凝胶，请参阅配方。
2. 量化细胞裂解物的蛋白质浓度。对于Bio-Rad蛋白测定，用蒸馏水将细胞裂解液稀释20倍，加入5μl稀释的细胞裂解液至245μl1x Bio-Rad蛋白测定，通过涡旋充分混合，并测量595 nm处的吸光度。使用稀释系列牛血清白蛋白（BSA）水溶液构建标准曲线
3. 在干净的微量离心管中，通过用不含EDTA的裂解缓冲液稀释制备1-3μg/μl细胞裂解物（10-30μg/10μl/孔），并加入6x样品缓冲液（2μl/孔）。 > （可选）对于磷酸酶处理，将10μg通过使用1％NP-40TBS缓冲液制备的细胞裂解物与含有1x NEBuffer forPMP（提供λPPase），1mM MnCl 2 和400UλPPase在30℃下60分钟。然后在37℃下与30U的CIAP进一步温育30分钟。通过添加6x样品缓冲液停止反应。
4. 将样品在100℃下加热5分钟，然后将样品冷却至室温（20-24℃）
5. 根据制造商的说明，在凝胶罐中设置手工或预制凝胶，并将导线连接到电源。在上下室缓冲器中使用运行缓冲器。
  注意：三甘氨酸运行缓冲液可用于手工凝胶（含Mn ^{2 +}）和预制凝胶（含Zn ^{2 +}），而Tris-MOPS运行缓冲液只能用于预制凝胶。成功地使用预制和手工凝胶来检测Tris-甘氨酸运行缓冲液中的IRF5磷酸化。对于其他蛋白质，有必要经验性地确定凝胶（金属离子）和运行缓冲液的哪种组合对于磷酸化检测是最佳的。
6. 将样品置于孔中（12μl/孔），并按如下方式运行凝胶：
转移和阻止
1. 在运行过程中，准备阻塞溶液（参见食谱）并将滤纸浸入转移缓冲液中
2. 运行完成后，从设备中取出凝胶并切断堆积凝胶。
3. 在室温下轻轻振荡（60rpm）将凝胶在含EDTA的转移缓冲液（25ml /凝胶）中孵育10分钟。丢弃缓冲区。
  注意：由于凝胶中的金属离子干扰转移，所以使用含EDTA的转移缓冲液，可在SDS-PAGE后从凝胶中除去。
4. 重复孵育两次（共三次）。
5. 在室温下轻轻晃动，将凝胶一次在无EDTA的转移缓冲液（25ml /凝胶）中孵育10分钟。
  注意：由于转移缓冲液中的EDTA也会干扰转移，因此使用无EDTA的转移缓冲液去除金属离子后从凝胶中除去EDTA。
6. 在甲醇中简单预湿PVDF膜，直到膜完全湿润，丢弃甲醇，加入转移缓冲液，并在室温下轻轻振荡（60 rpm）孵育至少10分钟。
7. 从半干吸墨纸的阳极（+）到阴极（ - ）按顺序堆叠5个滤纸，PVDF膜，凝胶和5个滤纸。用吸墨辊轻轻取出任何气泡。
8. 在室温下以100mA /凝胶（2mA电流/cm 2，凝胶）运行60分钟。
9. 当运行完成时，从堆叠中取出膜，并将膜在封闭溶液中孵育30分钟，同时在室温下轻轻摇动。
抗原抗体反应和ECL检测
1. 准备一级抗体溶液（用MaxBlot溶液1稀释3000倍的抗IRF5抗体）注意：使用封闭溶液（TBS-T中的5％脱脂乳）稀释抗IRF5抗体（Abcam）会引起非特异性条带的出现。对于其他抗体，如果知道通过标准免疫印迹分析方法促进出现正确的特定（优选单个）条带，则可以使用封闭溶液在磷酸酶标签免疫印迹分析期间稀释第一抗体。 br />
2. 用TBS-T冲洗膜，并在室温下将其在初级抗体溶液中孵育90分钟或在4℃温和摇动过夜。
3. 用TBS-T（每次洗涤5分钟孵育）洗膜5次
4. 制备二抗溶液（辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG抗体用封闭溶液稀释20,000倍）。
5. 在室温下，缓缓振荡，将二次抗体溶液中的膜孵育60分钟
6. 用TBS-T（每次洗涤5分钟孵育）洗膜5次
7. 按照制造商的说明，将ECL Prime或Immunostar ^{®的工作溶液中的膜孵育（用于高灵敏度检测）。}
8. 使用发光图像分析仪检测化学发光

数据分析

如图2所示，磷酸化的IRF5蛋白质可视化为向上移位的迁移带（参见图5的Ban等人，2016）。多个上移频带表示不同的磷酸化IRF5蛋白质种类。在BMDCs中，IRF5蛋白的一部分因CpG-B ODN（TLR9配体）的刺激而被磷酸化。
注意：

蛋白质的大小不能通过磷标记免疫印迹分析来确定，因为磷酸化蛋白质的迁移率偏移是由聚丙烯酰胺凝胶结合的Phos-标签（图1）捕获其磷酸基团引起的，而不是由于其尺寸磷酸化蛋白质通过Phos标签的附着而扩大。此外，以前已经表明，非磷酸化蛋白质的实际尺寸可以不同于其通过标准SDS-PAGE测定的估计大小（Kinoshita等人，2009）。最后，由于给定的磷酸化蛋白质的迁移率偏移与具有相同数量磷酸化的另一种蛋白质的迁移率偏移不同，所以不能使用该方案来确定在给定蛋白质上发生的磷酸化数量（Kinoshita等人，2006）。 em>
由于通过标准免疫印迹分析不能检测到多核苷酸化的IRF5，除非MG132（抑制泛素缀合的蛋白质降解的蛋白酶体抑制剂）和/或使用去泛素酶抑制剂如N-乙基马来酰亚胺和PR-619。
可以使用磷酸酶处理来确认上移频带是IRF5的磷酸化（参见Ban等人的图S5A，2016）。
通过比较野生型和IRF5缺陷型细胞之间的样品来证实抗体的特异性（参见Ban等人的图S5D，2016）。
可以将剩余的SDS-PAGE样品进行标准免疫印迹分析，以验证总IRF5蛋白和加载对照蛋白的量。

图2.通过磷酸化标签免疫印迹分析检测磷酸化的IRF5 BMDCs用0.15μMCpG-B寡脱氧核苷酸（ODN）刺激指定时间，并进行Phos-标签（上面板）或使用针对IRF5和GAPDH的抗体的标准（底部2图）免疫印迹分析。 GAPDH级别作为加载控制。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）
137 mM NaCl
8.1mM Na 2 HPO 4·12H 2 O
2.7 mM KCl
1.5mM KH PO 4
注意：不需要pH调节（pH约为7.4）。在4°C储存。
不含EDTA的裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.4）
150 mM NaCl
1％NP-40
0.5％脱氧胆酸钠
0.1％SDS
全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片
PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾酒片
注意：无EDTA溶解缓冲液不需要pH调节。抑制剂鸡尾酒片应该新鲜加入。没有抑制剂的缓冲液可以储存在4°C。
1％NP-40 TBS缓冲液（用于磷酸酶处理）
20mM Tris-HCl（pH8.0）
150 mM NaCl
1％NP-40
全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片
注意：1％NP-40 TBS缓冲液不需要pH调节。抑制剂鸡尾酒片应该新鲜加入。没有抑制剂混合物片剂的缓冲液可以在4°C储存。
6x样本缓冲区
375mM Tris-HCl（pH6.8）
9％SDS
50％甘油
0.03％BPB
9％2-巯基乙醇（2ME）
注意：6x样品缓冲液不需要pH调节。 2ME应该新增。没有2ME的缓冲液可以在室温下储存。储存缓冲液中沉淀的SDS可以通过加热至50°C来解决。
含有吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水 25mM Tris-HCl（pH7.4）
140 mM NaCl
3 mM KCl
0.05％吐温20
注意：TBS-T不需要pH调节;在室温下储存。
阻塞解决方案
TBS-T
5％脱脂牛奶
注意：为每个实验新鲜准备。
手工磷标签丙烯酰胺凝胶（迷你尺寸）
注意：使用ddH ₂ O而不是酒精覆盖分离凝胶。分离凝胶的聚合时间约为40分钟。在聚合后立即使用手工胶，不要存放以备后用。

分离（下）凝胶
7.5％丙烯酰胺/双（29：1）
375mM Tris-HCl（pH8.8）
0.1％SDS
100μMMnCl 2
50μM磷标签丙烯酰胺
0.1％APS
0.04％TEMED
注意：对于IRF5以外的蛋白质，首先优化丙烯酰胺/双（29：1）的浓度，然后根据需要改变磷标记丙烯酰胺的浓度。最初使用6％和8％丙烯酰胺/双（29：1）分析尺寸大于和小于60kDa的蛋白质。用于分析给定蛋白质的磷标记丙烯酰胺的最佳浓度可以选自一系列（20,50,100和150μM）。使用的MnCl 2的浓度应高于Phos标签丙烯酰胺的2倍。
堆叠（上）凝胶
4.5％丙烯酰胺/双（29：1）
125mM Tris-HCl（pH6.8）
0.1％SDS
0.1％APS
0.1％TEMED

Tris-甘氨酸运行缓冲液
25 mM Tris
192 mM甘氨酸
0.1％SDS
注意：无需pH调节（pH值为8.1-8.5）。在室温下储存。
Tris-MOPS运行缓冲区
100 mM Tris
100 mM MOPS
0.1％SDS
5mM亚硫酸氢钠
注意：亚硫酸氢钠应该新鲜加入。不需要pH调节（pH约为7.8）。不含亚硫酸氢钠的缓冲液可以在4°C储存。
转移缓冲区
48.2 mM Tris
38.9mM甘氨酸
0.037％SDS
20％甲醇
10mM EDTA（包括Phos-tag SDS-PAGE后凝胶的第一次，第二次和第三次孵育）注意：不需要pH调节（pH约为9.2）。在室温下储存。

致谢

感谢横滨市立大学的木村彦博士提出宝贵的意见。该方案改编自Wako的Phos-tag SDS-PAGE方案。这项工作得到了教育，文化，体育，科技部（MEXT）/日本科技部向T.T发展创新体系建设高新技术研究领域创新中心基金的支持。来自MEXT /日本科学促进会（T.B.的第16K19161号和25860368号）的补助金（KAKENHI）。

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