材料和试剂

无菌1.5ml微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）
15 ml管子
女性（如果需要，可以使用雄性小鼠）8-12周龄的C57BL / 6小鼠（THE JACKSON LABORATORIES）
气瓶（AirGas）中压缩的CO 2气体
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：288306）
无菌PBS pH 7.4（参考文献2）

设备

无菌尸检仪器（操作剪刀，镊子和镊子）避免污染
振荡器具有200转/分钟的容量和37°C的设置（或37°C的室内）

程序

不预充气室，将动物放入室内并引入100％的二氧化碳（只要可能，将家畜笼中的动物安乐死）。打开CO 2子罐或阀调节器以启动气体流。添加到室内现有空气中的二氧化碳每分钟约10％至30％的填充率应适合于实现平衡的气体混合物，以达到快速无意识的目的，同时对动物的痛苦最小。等待约3-5分钟，动物停止移动或呼吸。呼吸停止后至少1分钟保持CO 2次流。死亡被宫颈脱位证实。
使用操作剪刀打开腹腔以去除盲肠。使用操作剪刀，通过仔细切除以保持盲肠完好无损，不丢失任何内容。
用操作剪刀打开盲肠，并将盲瓶内容物加入到冰上的1.5ml微量离心管中。
取盲肠内容物，并稀释1:10在PBS（w / v）。加入终浓度为3％（v / v）的氯仿。
通过在37℃下以200rpm摇动30分钟来孵育盲肠内容物/氯仿混合物
在室温（约20分钟）下使氯仿沉淀到管的底部。
去除顶层水层以回收孢子并加入无菌的1.5ml管中。小心不要取任何已经沉降到管底部的氯仿。

数据分析

使用Clostridia特异性引物的实时PCR用于随后分析通过该方案分离的接种孢子的小鼠粪便中梭菌的对数CFU（Rivera-Chávez等人，2016）。在统计分析之前，将对比的折叠变化（mRNA水平）进行对数转换。使用不配对的Student's 测试来确定组之间的折叠变化的差异是否具有统计学意义（P <0.05）。

笔记

每只小鼠每天要排出100〜200毫克的盲肠内容物
一旦鼠标已被安乐死以确保孢子的最大回收率，收集盲肠内容物是非常重要的。
使用无菌技术在转移到无菌的1.5 ml管中时不会污染盲肠内容物
如果将准备来自多个小鼠的汇集的盲肠内容物，则可以使用15ml管来容纳更大的体积。
隔离的孢子应该是新鲜的（隔离当天），以确保孢子的最大生存力。我们不建议储存孢子。

致谢

该工作由公共卫生服务授权AI096528（AJB），AI112949（AJB），AI103248（SEW），AI112241（CAL），OD010931（CALI）等提供支持。 EMV）和AI060555（EMV和FR-C）。

参考

Momose，Y.，Maruyama，A.，Iwasaki，T.，Miyamoto，Y.and Itoh，K。（2009）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/19614852"target ="_ blank"> 16S rRNA基因序列分析与无菌小鼠转化为正常状态有关的梭菌 .J Appl Microbiol 107（6）：2088-2097。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（2006）。冷泉Harb Protoc 。
Rivera-Chávez，F.，Zhang，LF，Faber，F.，Lopez，CA，Byndloss，MX，Olsan，E.，Xu，G.，Velazquez，EM，Lebrilla，C.，Winter，SE andBäumler，AJ （2016）。从肠道微生物群中消耗产生丁酸梭菌的梭菌驱动沙门氏菌的有氧管腔扩张。细胞宿主微生物 19： 443-454。
Yano，J.M.，Yu，K.，Donaldson，G.P.Shastri，G.G.，Ann，P.，Ma，L.，Nagler，C.R.，Ismagilov，R.F.，Mazmanian，S.K。和Hsiao，E.Y。（2015）。来自肠道微生物群的土着细菌调节宿主血清素生物合成。细胞 161（2）：264-276。