材料和试剂

移液器提示
无菌塑胶牙签
培养管（50ml）
1.5 ml微量离心管
玻璃幻灯片
封面
白色念珠菌株CAF2-1（URA3 / ura3 :: imm434 iro1 :: imm434）和条件用于本研究的编码GPI生物合成途径中第一个甘露糖基转移酶的催化亚基的CaGPI14（CAF2-1 :: Cagpi14 / pMET3-CaGPI14）的无效突变体
在本研究的实验室中制备了具有尿苷 Cys ^{- Met ^{- 的合成定义的（SD）培养基，因为菌株是尿苷营养缺陷型。 Cys / Met用于抑制CaGPI14表达（所有L-氨基酸均得自Sisco Research Laboratory）。这是可能的，因为条件突变株具有放置在MET3启动子控制下的唯一存活等位基因的CaGPI14，其允许在不存在Cys / Met的情况下进行基因表达，并且在Cys / Met
的存在下压制其表达}}
来自松林科学服务有限公司（FL1S-C）的液体FLAER（25μg/ 0.5ml）
50％甘油（Merck，目录号：1.07051.0521）
D-葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16-500）
酵母氮基（HiMedia Laboratories，目录号：M878）
半胱氨酸（Sisco Research Laboratory，目录号：034890）
甲硫氨酸（Sisco Research Laboratory，目录号：134869）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：15915）
氯化钾（KCl）（默克，目录号：1049360500）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-3）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Merck，目录号：1.93205.0521）
盐酸（HCl）
SD Uri ^{+ Cys ^{- Met ^{- / SD Uri ^{+ Cys ^{+ sup> + 肉汤（100ml）（参见食谱）}}}}}
磷酸盐缓冲盐水（PBS; pH 7.5）（参见食谱）

设备

移液器
100-1,000μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：4642090）
20-200μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：4642080）
2-20μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：4642060）}}}
涡街搅拌机（REMI GROUP，型号：CM-101）
振荡器培养箱（根据需要设置在30°C或20°C）（Labtech，型号：LSI-5002M）
离心机（Plasto Craft Industries，型号：Micro-spin R-V / FM）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，型号：Multiskan ^{TM GO微孔板分光光度计，目录号：51119300）}}
安道尔纺丝盘共焦显微镜
高压灭菌器

软件

安道尔iQ2.7（用于图像捕获）
GIMP 2.8.18软件（用于量化）
Origin 0.5软件

程序

将所有菌株的原代培养物置于10ml SD Uri Cys ^{Met ^{- 培养基中，使用采集的原料培养物用无菌塑料牙签。允许培养物在30℃振荡条件下以220rpm生长过夜。}}
在新鲜合适的培养基（CAF1-1，SD Uri Cys ）中，用2％过夜培养的培养物（200μl，10ml中培养过夜培养物） > Met ^{- > [允许]以及SD Uri ^{+ Cys ^{+ Met ^{+ [镇压]介质）在30℃下摇动（220rpm ）。}}}}
在生长5小时（对数期）后，通过在室温（30℃）下以3,000×g离心5分钟将细胞离心。对照期细胞是优选的，因为我们观察到在生长晚期和稳定期的Cagpi14突变细胞中广泛的细胞聚集。同样重要的是要指出，在饱和培养物中，可能会引发细胞死亡过程，这又会改变细胞壁和膜的稳定性，影响细胞的染色。为了避免这些问题产生的错误，优先使用对数阶段单元。
用PBS以3,000×g离心清洗细胞沉淀，并重新悬浮在10ml PBS中。
在每种情况下，对应于OD 600> nm 0.6的细胞相等数目，并在1.5ml微量离心管中重悬于200μlPBS的总体积中。
将FLAER（10μl，50μg/ ml，即0.5μg）加入200μl细胞悬液（1:20稀释）中。
在约500rpm的温和涡旋后，将细胞悬浮液在20℃在黑暗中的摇动培养箱（70rpm）中孵育1小时。
然后将细胞以3,000xg离心3分钟，并通过移液将细胞沉淀用PBS洗涤三次。
对于微观分析，将细胞沉淀重悬于40μl50％甘油（v / v水溶液）中
5μl细胞悬浮液被点在玻璃片上，盖上盖子。
使用具有Alexa 488滤色器的共聚焦荧光显微镜捕获细胞的荧光图像，分别具有用于荧光和DIC图像的0.4秒和0.2秒曝光时间。相机EM增益为100，相机曝光单位为1，适用于两种类型的图像。获得结果的代表性图像如图1所示

图1. FLAER标记细胞的共焦成像野生型（CAF2-1）和Cagpi14 条件无效突变体细胞在许可下的图像（Cys ^{- Met ^{- ）以及如上所述与FLAER孵育后的抑制（Cys ^{+ Met ^{+ ）条件。每个图像中的比例尺= 10μm。}}}}

数据分析

荧光强度的定量：

使用Nikon-AR分析或GIMP软件可以量化细胞的荧光强度。对于每个菌株，计数至少50个细胞的荧光强度。对于此处绘制的数据，使用GIMP软件进行定量。量化的示意图如图2所示。通过使用Microsoft Excel中的Student's t -test来计算数据的统计显着性的值。

图2.使用GIMP 2.8.18软件对荧光强度进行定量的示意图单荧光细胞的定量显示为例。
参照野生型菌株（CAF2-1）的荧光强度作为100％绘制突变体的相对强度。
数据点以条形图的形式绘制在Origin 0.5软件（图3）中。
在上述实验中，与野生型菌株CAF2-1相比，在条件无效突变体（抑制条件下）中发现约40％的低荧光。在许可条件下，相对于野生型菌株，仅观察到荧光强度降低了20％

图3. FLAER标记细胞的相对荧光强度的定量。将Cagpi14条件无效突变体细胞的荧光强度百分比相对于野生型（CAF2- 1）细胞（100％）。值 - 值= 0.003（**）。

笔记

应在生长对数阶段用来自次生培养物的细胞进行标记。
应避免促进细胞聚集的条件，因为这会导致细胞数量估计和染色水平的错误。
图像应在标签的同一天被捕获。

食谱

SD Uri ^{+ Cys ^{- Met ^{- / SD Uri ^{+ Cys ^{+ sup> + 肉汤（100ml）
2 g D-葡萄糖
0.67克YNB
0.2g Uri ^{- Met ^{- 辍学混合物（L-半胱氨酸，L-甲硫氨酸和尿苷除外的所有L-氨基酸的混合物; 1g腺嘌呤[0.25g]和对氨基苯甲酸[0.1g]除外）各氨基酸1g 1 M尿苷溶液（在高压灭菌水中制成）
将上述化学品加入80ml双蒸水中，溶解
加入500μl1 M尿苷溶液，使体积达到100 ml
将SD Uri ^{+ Met ^{+ 将SD添加半胱氨酸（5mM）和甲硫氨酸（5mM） Cys ^{- Met ^{- medium和高压灭菌器}}}}}}}}}}}
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.5（1L）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
将上述化学物质溶于800毫升双蒸水中用HCl调节pH至7.5 用双蒸水补足体积

致谢

上述协议是从我们以前的研究（Singh等人，2016）改编而来的。这项工作由印度医学研究委员会（ICMR）到SLS的高级研究奖学金和印度科学技术部（DST）的研究资助（SB / OC / CB-03A / 2014）资助。 SSK。

参考

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