材料和试剂

无菌移液器吸头和血清移液器（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ）}
Optilux非组织培养10厘米培养皿（康宁，目录号：430591）
无菌50和15毫升锥形管（Denville）
1 ml注射器，带26 G标针（BD，目录号：309625）
70微米的细胞过滤器（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：22-363-548）}
组织培养24孔板（平底）（Corning，Costar ^{®，目录号：3524）}
组织培养96孔板（平底）（康宁，目录号：3595）
无菌细菌接种针或环
无菌5毫升带细菌培养瓶的管（康宁，目录号：352058）
组织培养6孔板（平底）（Corning，Costar ^{®，目录号：3516）}
20 G规针（BD，目录号：305175）
3 ml注射器（BD，目录号：309656）
带机架的FACS管（国家科学，目录号：TN0946-01R）
老鼠：
1. 野生型C57BL / 6J小鼠
  注意：我们最初从“杰克逊实验室”购买了这些产品，然后在西奈山的伊坎医学院的鼠标设备中培育至少5年。
2. 表达与CD4配对的小鼠α链和β链T细胞受体的OT-IITCR转基因小鼠（菌株B6.Cg-Tg（TcraTcrb）425Cbn / J）（THE JACKSON LABORATORIES，目录号：004194）并且在IAb的情况下对来自鸡卵白蛋白（OVA 323-339 ）的表位是特异性的
3. 1H3.1 TCR转基因小鼠，其表达与CD4受体配对的小鼠α链和β链T细胞受体，并且对IE II类分子的α链的52-68片段是特异性的（Eα<亚> 52-68 肽）
抗原来源：
1. 细胞载体：A20细胞系（ATCC，目录号：TIB-208）
2. 细菌：表达卵白蛋白（OVA）作为重组蛋白的单核细胞增生利斯特氏菌（PEEE等人，2001）
3. 纯化肽：OVA 329-337（序列ISQAVHAAHAEINEAGR）和Eα52-68（序列ASFEAQGALANIAVDKA）
70％乙醇
1x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
红细胞裂解液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757）
细菌生长培养基：脑心脏输注（BHI）肉汤（BD，Bacto ^{TM，目录号：237500）}
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
抗CD95抗体，克隆Jo2（BD，BD Biosciences，目录号：554255）
台盼蓝染色（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ，目录号：15250061）}
胎牛血清（FBS）
EDTA二钠二水合物（Biological Industries，BI，目录号：41-922），溶于pH = 8的PBS中，储备溶液0.5M
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
用于T细胞阳性选择的抗CD4磁性微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-201）
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：65-0850-84）}
抗小鼠CD4-APC，克隆RM4-5（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：14-0042）}
可选：抗小鼠CD11c（克隆N418），CD11b（克隆M1 / 70）和MHC-II（克隆M5 / 114.15.2）标记物
RPMI（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
GM-CSF
注意：我们曾用GM-CSF cDNA转染的J558细胞制备GM-CSF（Liu等，2006，p.148），但也可购买重组GM-CSF。 />
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
HEPES溶液bioxtra，1M，pH 7.0-7.6（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
MEM，非必需氨基酸（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
IMDM（Sigma-Aldrich，目录号：I3390）
Fc区：大鼠抗小鼠CD16 / 32，克隆2.4G2（BD，BD Biosciences，目录号：553141）
叠氮化钠（NaN 3 N 3）（Sigma-Aldrich，目录号：13412））
注意：本产品已停产。
BMDC培养基（见食谱）
A20细胞培养基（参见食谱）
T细胞培养基（参见食谱）
FACS缓冲区（见配方）

设备

单通道移液器，1，20，200和1,000μl
剪刀
镊子
层流罩
台式离心机
血细胞计数器或自动细胞计数器
细胞培养箱（37℃，5％CO 2 ）
细菌培养箱（37°C），带摇床
无菌100ml锥形瓶
烧瓶用于细胞培养
光密度（OD）读者
MACS列，LS列（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
MACS分隔符
注意：我建议使用QuadroMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-976）
流式细胞仪

软件

流式细胞仪分析软件，FlowJo，LLC

程序

骨髓分离和树突细胞分化培养
1. 根据机构IACUC建议，使用CO 2牺牲小鼠。
2. 用70％乙醇喷洒整个小鼠毛皮以避免污染。
3. 使用剪刀在臀部区域切割毛皮，将皮肤从腿部向脚部向下拉。
4. 一旦皮肤被去除，切成骨盆，并用剪刀去除胫骨和股骨。
5. 使用剪刀切断所有肌肉/脂肪组织，用镊子和干净的骨骼夹持胫骨和股骨。
注意：步骤A2至A4可以在干净的工作台上进行。
1. 将清洁的骨头放置在层流罩下方，无菌无菌地加入到带有冰冷无菌PBS的10厘米培养皿中。
2. 用新鲜无菌冷PBS填充1ml注射器，通过用镊子夹住骨头，将针插入一只手，另一只手将另一只手冲入含有2-3ml无菌冷PBS的第二培养皿中。
3. 使用相同的注射器通过上下传递制作单细胞悬浮液。
4. 用PBS从第二培养皿补充注射器，重复步骤A6和A7，直到骨骼变得清晰。
5. 通过过滤70μm细胞过滤器将细胞收集在圆锥形的50ml管中，以去除骨碎片和组织的任何污染。通过上下移动1-2ml PBS洗涤培养皿，以确保回收所有骨髓细胞，并通过70μm细胞过滤器加入50ml管中。
6. 使用冰冷的PBS将锥形50ml管的最终体积调节至30-40ml。
7. 颗粒细胞在435 x g下5分钟。
8. 去除上清液并重悬于1ml红细胞裂解缓冲液中，室温孵育1分钟，然后加入25ml PBS洗涤细胞，并以435g离心5分钟。
9. 将沉淀重悬于5ml骨髓树突状细胞（BMDC）培养基（参见食谱）中，并使用干净的70μm细胞过滤器在新的50ml锥形管中过滤以除去死细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数器计数细胞。通常来自1只成年小鼠10周龄，产量应为40×10 6个细胞。
10. 使用BMDC培养基将体积调节至10×10 6细胞/ ml的密度，并在24孔组织培养板中每孔1ml板。
11. 在细胞培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育5天，在培养的第3天加入1ml BMDC培养基。这是第0天。BMDC是半粘附的圆形细胞，当不成熟时不应显示延伸的树突。 BMDC纯度可以通过使用抗小鼠CD11c和MHC-II标记的流式细胞术进行评估
12. 在使用前，通过轻轻移液培养基去除BMDC后，从1孔计数细胞，并用1ml冰冷的PBS洗涤孔。这个细胞数量应该在整个24个孔中是恒定的。在279 xg离心5分钟。
13. 将直接添加到BMDC培养物中的吞噬货物（参见方法B）重悬于200μlPBS或培养基中，然后以279×g离心24孔板2分钟。
  1. 或者，为了除去未分化的BMDC并附着于板的污染细胞，可以如步骤A12所述从24孔板除去BMDC，并在新板中重新填充。
  2. 孵育BMDC（补充或不补充）与吞噬货物8小时。
  3. 留下一些没有吞噬量的BMDC用肽控制剂脉冲（见下面的步骤A17）。
14. 收获BMDC，收集在锥形管中，用冷PBS洗涤
15. 离心5分钟，279
16. 以10 6细胞/ ml的浓度重悬于T细胞培养基（参见食谱）。
17. 在加入T细胞之前，在96孔板中加入100μlBMDC。脉冲未刺激的BMDC，其具有1μg/ ml的OVA 329-337和在分开的孔中的Eα52-68肽。 BMDC可以留在冰上，直到T细胞准备就绪
吞噬货物准备
1. 单核细胞增生利斯特氏菌文化
  1. 感染前一天，准备细菌预培养：用针或环无菌挑取一批来自原种的冷冻细菌，并用3ml BHI培养基接种到5ml的管中。
  2. 在37℃的培养箱中以250rpm的速度孵育16小时
  3. 第二天，用无菌烧瓶稀释20ml新鲜BHI培养基的过夜培养物1/20。盖上并在37℃培养箱振荡器中孵育，直到培养物达到指数期（0.5 1对应于5×10 8细菌/ ml），并计算细菌浓度需要感染A20细胞和BMDC多种感染（moi）为100的文化
  4. 将适量体积的细菌培养物转移到一个或多个50ml管中，以3,113×g离心10分钟，用无菌PBS洗涤两次。
  5. 在细胞培养物中每孔加入PBS或BMDC培养基中的细胞200μl。
    注意：在加入BMDC之前，细菌应该在37℃下在含有50μl氨苄青霉素的PBS中孵育2小时而灭活，而A20细胞用活细菌感染。
2. A20细胞作为细胞凋亡细胞的制备
  1. A20细胞在37℃，5％CO 2的细胞培养箱中，在A20细胞培养基（参见食谱）的小烧瓶中生长。
  2. 在测定前三天，通过上下移液移出瓶中的A20细胞，并在50ml锥形管中转移。
  3. 计数A20细胞，以279 x g离心5分钟，并将其重悬于1×10 6细胞/ ml的新鲜培养基中。
  4. 在6孔板中每孔3ml细胞板，并置于培养箱中
  5. 诱导A20细胞凋亡：
    A20细胞通过抗CD95（FasR）处理而被凋亡，有或没有以前的细菌感染，然后用作平原（=未感染）或感染的凋亡载体。
    1. 细胞凋亡细胞：
      在第5天，取出并计数A20细胞，以279×g离心5分钟，然后将其重新悬浮并以1×10 6细胞/孔加入6孔板中3ml， ml，含最终浓度为0.5μg/ ml的抗CD95的新鲜培养基在细胞培养箱中孵育2小时。抗CD95治疗的持续时间可以变化，应由每位研究者精确确定。细胞凋亡可以通过7ADD和Annexin V染色后的流式细胞术检测（凋亡细胞应为Annexin V阳性和7ADD阴性）。
    2. 感染的凋亡细胞
      在第5天，取出并计数A20细胞，以279×g离心5分钟，然后将其重新悬浮并以1×10 6细胞/孔加入6孔板中3ml， ml的新鲜培养基。在moi = 100中加入200μl的李斯特菌。在细胞培养箱中孵育8小时。
      8小时后，加入终浓度为50μg/ ml的氨苄青霉素（杀死所有细菌）和0.5μg/ ml抗CD95至培养物中，再培养2小时。
  6. 收获和计数凋亡细胞（台盼蓝染色后不应该出现蓝色 - 超过90％必须是台盼蓝，否则不能用于测定，研究人员应重新进行抗紫外线的持续时间， CD95治疗）
  7. 以279 x g离心5分钟，并重悬于200μlPBS或培养基中。
  8. 凋亡细胞以1:2（BMDC：凋亡细胞）的比例立即加入BMDC培养物中8小时。
CD4 T细胞分离和CFSE标记
1. 收获脾，并在含有5ml冷PBS的10cm陪替氏培养皿中制备细胞悬浮液，通过将组织挤压通过70μm细胞过滤器，然后使用20G针头和3ml注射器均质化。通过使用相同的注射器上下通过单细胞悬浮液。通常，一只小鼠脾脏含有1×10 8个脾细胞。
2. 将细胞悬浮液转移到15ml锥形管中，并以435g离心5分钟。
3. 可选：取上清液并重悬于1 ml红血裂解缓冲液中，室温孵育1 min，然后加入13 ml PBS洗涤细胞，并以435 x g离心5 min。可以跳过这一步，因为在CD4 + sup + T细胞阳性选择的步骤中消除红细胞。
4. 在含有1μg/ ml抗Fc受体，2％FBS，2mM EDTA，100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素和用于CD4T细胞阳性选择的抗CD4磁性微珠的1ml PBS中孵育脾细胞（Miltenyi Biotec ），根据制造商的说明。
5. 根据制造商的说明，按磁性柱（Miltenyi Biotec）进行CD4 ^{+ T细胞阳性选择。}
6. 以2×10 6细胞/ ml的浓度计数并重新悬浮于PBS中纯化的CD4T细胞。
7. 将CFSE（终浓度为2.5μM）缓慢加入细胞，同时轻轻涡旋管。在黑暗中37℃孵育10分钟。
  注意：使一些CD4 T细胞未染色，以进行流式细胞术补偿。
8. 通过完全填充管并用435×g离心5分钟，用PBS洗涤两次。细胞成功的CFSE染色应该会产生黄色/绿色颗粒
9. 以2×10 6细胞/ ml的浓度将细胞重悬于T细胞培养基中。
10. 将100μlCD4 T细胞添加到先前接种BMDC的96孔板中。
  注意：OT-II和1H3.1 TCR转基因CD4T细胞应铺在分开的孔中以避免抗原竞争。
11. 共培养CD4T细胞和BMDC 5天
评估抗原呈递
1. 在第5天，用含有200μlFACS缓冲液（参见食谱）的CD4T细胞和BMDC的共培养物的板洗涤两次，通过在778×g离心2分钟。丢弃上清液。
2. 在FACS缓冲液中加入100μl抗小鼠CD4（1/100），并在黑暗中在冰上孵育20分钟。
3. 用200μlFACS缓冲液洗涤两次。
4. 重悬于200μlFACS缓冲液中，流式细胞术检测

数据分析

应准备以下条件（至少重复）：

OT-II CD4 T细胞+吞噬细胞凋亡A20细胞的BMDC =无T细胞增殖。
吞噬吞噬李斯特菌的OT-II CD4 T细胞+ BMDC -OVA感染的凋亡A20细胞= T细胞增殖。
OT-II CD4 T细胞+利用李斯特菌感染的BMDC -OVA = T细胞增殖。
OT-II CD4 T细胞+用OVA 329-337脉冲的BMDC = OT-II CD4 T细胞增殖阳性对照。
用Eα52-68肽脉冲的OT-II CD4 T细胞+ BMDC = OT-II CD4 T细胞增殖的阴性对照。
1H3.1吞噬细胞凋亡A20细胞的CD4 T细胞+ BMDC =无增殖
1H3.1吞噬李斯特菌的CD4T细胞+ BMDC -OVA感染的凋亡A20细胞= T细胞增殖。
1H3.1用李斯特氏菌感染的CD4T细胞+ BMDC -OVA =无T细胞增殖。
1H3.1用OVA 329-337脉冲的CD4T细胞+ BMDC = 1H3.1 CD4 T细胞增殖的阴性对照。
1H3.1用Eα52-68肽脉冲的CD4T细胞+ BMDC = 1H3.1 CD4 T细胞增殖的阳性对照。
A20细胞是表达I-E II类分子的Balb / c衍生的B细胞系。在感染的凋亡A20细胞吞噬后，微生物和凋亡物质的同时分隔使BMDC能够处理并呈递细菌衍生的抗原OVA 329-337和细胞衍生的抗原Eα52 -68 ，诱导OT-II和1H3.1 CD4T细胞的增殖。另一方面，在没有感染和TLR刺激的情况下，来自细胞凋亡细胞的抗原不能呈现，并且不应该观察到1H3.1 CD4T细胞的增殖（图1）。

图1.通过TLR活化的抗原呈递的调节在该方案中，通过抗原特异性CD4T细胞的增殖来评估抗原呈递，所述抗原特异性CD4T细胞在与抗原呈递细胞孵育5天之后稀释CFSE（APC，（A）或感染（C）凋亡细胞，或已被表达重组蛋白卵白蛋白（OVA）（B）的细菌单核细胞增生利斯特氏杆菌感染的骨髓衍生树突状细胞）。我使用A20细胞系作为凋亡载体，其表达由TCR转基因1H3.1 CD4T细胞识别的Balb / c衍生的Eα52-68抗原。来自重组细菌李斯特菌 - 单核细胞增生李斯霉素的OVA 329-337抗原被TCR转基因OT-II CD4 T细胞识别为微生物抗原。
如图1所示，凋亡细胞的吞噬作用随后是货物的溶酶体降解，并且不发生抗原呈递（图1A），而在细菌感染期间TLR活化促进吞噬体成熟以获得最佳微生物抗原呈递（图1B）。当凋亡细胞被感染时，在相同的吞噬体中发现凋亡细胞和微生物的货物，其中TLR信号的存在有利于自身和细菌衍生抗原的抗原呈递（图1C）。

笔记

每个菌株一个小鼠（C57BL / 6J，OT-II和1H3.1 TCR转基因）应该给足够的细胞进行整个实验。
我们观察到抗原刺激后CD3的下调，因此不需要进行抗CD3染色。对于流式细胞术分析，只需在活CD4 + sup + T细胞上敲门。这种门控策略也足以排除BMDC。或者，您可以使用抗小鼠CD11c和CD11b标记染色BMDC。
该协议的替代版本可以在Blander和Medzhitov（2006）和Nair-Gupta等人中找到。（2014）。后一篇论文描述了在CD8 T细胞的上下文中的体外抗原呈递测定。

食谱

BMDC媒体
用10ng / ml GM-CSF和5％FBS，加100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1nM丙酮酸钠，1×MEM非必需氨基酸，和2.5μMβ-巯基乙醇
A20细胞培养基使用10％FBS，加100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1nM丙酮酸钠，1×MEM非必需氨基酸和2.5μMβ-巯基乙醇的RPMI， >
T细胞培养基用10％FBS，100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1nM丙酮酸钠，1×MEM非必需氨基酸和2.5μMβ-巯基乙醇完成IMDM， >
FACS缓冲区
具有2％FBS的1x PBS，加上1μg/ ml Fc阻滞物和0.1％NaN 3

致谢

L.C.得到了关节炎基金会研究奖学金的支持。本文描述的协议是基于Campisi等人的论文。（2016）。 L.C.感谢Ivan Marazzi的建议和支持。 1H3.1用于Campisi等人的TCR转基因小鼠。（2016）是从Adrian Morelli到J. Blander实验室的物质转让协议（MTA）的礼物。
作者声明没有利益冲突。

参考

Blander，JM和Medzhitov，R。（2004）。＆nbsp; 通过来自收费样受体的信号调节吞噬体成熟。科学 304（5673）：1014-1018。
Blander，JM和Medzhitov，R。（2006）。＆nbsp; Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells。自然 440（7085）：808-812。
Campisi，L.，Barbet，G.，Ding，Y.，Esplugues，E.，Flavell，RA and Blander，JM（2016）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：// www .ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 27455420“target =”_ blank“>响应于微生物感染的细胞凋亡诱导自身反应性TH17细胞。 Nat Immunol 17（9）：1084- 1092.
Liu，K.，Charalambous，A.and Steinman，RM，（2006）。＆nbsp; 小鼠中树突状细胞的一些生物学特征。在Fox：J.，Barthold，S.，Davisson，M 。，Newcomer，C.，Quimby，F.和Smith，A.（Eds。）。生物医学研究中的鼠标。 Academic Press ，pp：135-249。

Nair-Gupta，P.，Baccarini，A.，Tung，N.，Seyffer，F.，Florey，O.，Huang，Y.，Banerjee，M.，Overholtzer，M.，Roche，PA，Tampe，，Brown，BD，Amsen，D.，Whiteheart，SW and Blander，JM（2014）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed / 25083866“target =”_ blank“> TLR信号从内体回收室诱导吞噬细胞MHC-I递送以允许交叉表达。细胞 158（3）：506-521。 br />

教授，C.，Kim，SK，Marzo，A.，Masopust，D.，Williams，K.，Jiang，J.，Shen，H。和Lefrançois，L。（2001）。＆nbsp; CD8 T细胞对单核细胞增生利斯特氏菌感染反应的器官特异性调节。 em Immuno 166（5）：3402-9。