材料和试剂

sgRNA表达载体的制备
1. Bsa I（New England Biolabs，目录号：R0535）
2. T4 DNA连接酶（Promega，目录号：M1801）
3. 清洁和凝胶提取试剂盒（Biokit，目录号：Bio-C300）
4. 2x连接缓冲液（Promega，目录号：C671A）
5. pGEM-T Easy TA克隆试剂盒（Promega，目录号：A1360）
6. Plasmid Miniprep Kit（Biokit，目录号：Bio-P300）
7. Genomic DNA islation Kit（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：K0721）}
8. Neon ^{TM转染系统100μl试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：MPK10096）}}
9. 氯化铯（CsCl）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{，目录号：4042-02）}
10. Tris-HCl，pH 8.0
11. EDTA，pH 8.0
12. 氯化钠（NaCl）
13. TE缓冲（见配方）
14. TEN缓冲（见配方）
收集猪胚胎
1. 用于胚胎闪烁的玻璃管（外径为4mm的玻璃管，如图2所示）
2. Falcon管，50ml（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：339653）}
3. Regumate ^{®（含有0.4％Altrenogest，Intervet，MSD，France，品牌名称：Regumate ^®）}
4. PMSG（怀孕母马血清促性腺激素）（ASFK Pharmaceutical，Japan，品牌：PMSG）
5. hCG（人绒毛膜促性腺激素）（ASKA Pharmaceutical，日本，品牌：hCG）
6. PGF2α（前列腺素F2α;雌激素注射液）（Intervet Deutschland，德国）
7. D-PBS（GE Healthcare，HyClone ^{TM，目录号：SH30028.02）}
8. 胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone ^{TM，目录号：SH30071.03）}
胚胎移植
1. 3M纸带（3M，目录号：200-24mm）
2. 硫酸阿托品（TAI YU CHEMICAL＆amp; PHARMACEUTICAL）
3. Stresnil（azaperona，40mg / ml）（Janssen Pharmaceutica N.V.，Belgium，品牌：Stresnil）
4. 柠檬酸钠（Thiamylal sodium）（Shinlin Sinseng Pharmaceutical，Taiwan，品牌：Citosol）
5. 阿莫西林（氨苄青霉素，150mg / ml）（中国化学药业，CCPG，目录号：E000853）
6. 肝素钠（中国化学与制药，CCPG，台湾，品牌：AGGLUTEX INJECTION）

设备

sgRNA抑制载体的制备
1. 配备NVTi65转子的超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XL-80）
2. 微量离心机（KUBOTA，型号：3740）
3. 干浴培养箱（主要科学，型号：MD-01N）
4. 热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，型号：2720）}
精液评估
1. 计算机辅助精子分析系统（UltiMate CASA系统，Hamilton-Thorne Research，Beverly，MA）
显微注射
1. 离心机（KUBOTA，型号：8920）
  注意：本产品已停产。
2. 微量离心机（KUBOTA，型号：3740）
3. 倒置差分干涉对比显微镜（Olympus，型号：IX71）
4. 毛细管注射针（Sutter Instrument，目录号：BF100-78-10）
5. 毛细管注射针拔出器（Sutter Instrument，型号：P-97）
6. 微操纵器（NARISHGE，型号：ON3-99D）
7. 注射器（NARISHGE，型号：IM-9B）
收集猪胚胎和胚胎移植
1. 操作表（NEWPORT，LW3048B-OPT，振动隔离表）
2. 手术机械设计（NARISHIGE，JAPAN）

程序

sgRNA表达载体的制备
1. 取10μg的ppU6-（BsaI）2'-gRNA，并将其在50μl的Bsa I中在100μlNEB3.1缓冲液中在37℃下消化2 h。
2. 用清理试剂盒纯化线性化载体DNA，并用30μl1 / 10x TE洗脱。储存纯化的线性化载体在-20°C使用前。
3. 将表1中列出的引物溶解在TE中，并将浓度调节至50μM 注意：
  1. 将每个10μl正向和反向引物（表1，每个50μM）加入到小瓶中并与30μlTEN混合。在干燥块加热器中将混合物在90℃下孵育10分钟。
  2. 将混合物转移到65℃的干燥块中并孵育30分钟。然后让块逐渐冷却至室温约30分钟。将退火的引物对置于冰上直到下列连接反应
    表1. ppU6-sgRNA表达载体构建的引物
    
    猪GGTA1基因的最后一个外显子的第一个核苷酸被编号为+1，最后一个内含子的最后一个核苷酸被编号为-1（Su et al。，2015）。
4. 对于连接反应，将1μlBsaI消化载体，3μl退火引物对，5μl2x连接缓冲液和1μlT4 DNA连接酶混合在冰上的小瓶中。然后在16℃孵育小瓶90分钟进行连接反应
5. 转化后，从各个菌落分离质粒样品。使用M13反向引物进行DNA测序（注1）
6. 通过两轮CsCl密度梯度超离心法纯化DNA进行原核显微注射。通常使用NVTi65转子，在20℃下将离心条件设定为218,000×g 20小时。
动物和动物护理
1. 提高特定病原体免费农场的所有动物。喂食有限制饮食（4％体重）的动物免费使用水。
2. 通常提高收件人，特别是在分娩期间特别小心处理。
3. 所有动物应根据您的联邦和机构指导进行管理和治疗。
同步和超排卵
1. 通过喂养补充有Regumate ^{®（含有0.4％Altrenogest; Intervet，MSD，France）的商业日粮15天，使供体和受体同步，以使其发情周期同步。向Regumate ^{®送达收件人一天。}}
2. 在喂食Regumate ^{®的最后一天，肌内注射PGF2（250μgCloprostenol）以溶解任何剩余的黄体。}
3. 对于超排卵诱导，用PMSG和hCG肌内注射所有猪，分别诱导卵泡生长/卵母细胞成熟和排卵。简单来说，在最后一次喂食Regumate ^{®的第二天，注射所有捐助者2,000 i.u.的PMSG。然后用1,500 i.u注射他们hCG 78 h后用同样的方案注射接受者1,500 i.u. PMSG和1,250 i.u. hCG分别诱导卵泡生长/卵母细胞成熟和排卵。}
4. 对于人工授精，在hCG注射后24小时和36小时通过计算机辅助精子分析系统评估，通过计算机辅助精子分析系统评估含有至少30亿可行精子的新鲜稀释精液，具有80％迁移率。通过相同的方法诱导接受者的同步排卵，延迟12小时，无需授精。
原核卵母细胞恢复
1. 在hCG注射后54-56 h内，全部捐献者都要牺牲上部子宫角和输卵管。
2. 为了收集合子，请用玻璃管插入和连接漏斗，将D-PBS引导入50ml Falcon管。通过将20ml具有20％胎牛血清（FCS）的D-PBS注射到子宫交界处的输卵管中，从输卵管冲洗受精卵。（图2）
3. 将DPBS中的胚胎保留在37℃的保温箱中，并在30分钟内将其携带到实验室进行进一步的微操作。
  
  图2.从猪输卵管冲洗新受精卵。成熟和排卵由具有排卵点的毛囊（箭头1）指示。使用具有钝端的不锈针（＃19）穿透子宫壁，并将其穿过子宫交界处（箭头2）插入输卵管（箭头3）。玻璃管（箭头5号，外径4 mm）通过漏斗开口（箭头4）连接到输卵管的另一端。输卵管内的受精卵用注射器（箭头6）用20ml D-PBS冲洗，并收集在50ml Falcon管（箭头7）中。
显微注射
1. 将回收的受精卵以15,000 x g离心10至15分钟，以暴露其原核（图3）。
  注意：
  1. 然后将胚胎放入装有差分干涉对比度系统的倒置显微镜上的20μlD-PBS微滴中。
  2. 在300倍放大倍数下执行原核显微注射。
  3. 将胚胎置于适当的位置，以显示原核的清晰视图。
2. 然后通过毛细管针将CRISPR / Cas9 DNA混合物显微注射入一个原核。注射吸管的尖端开口直径约为0.5μm。在施加注射压力后，通过将受精卵从显微注射毛细管的尖端移开来显示DNA的连续流动流。在注射到原核中之前，将移液管尖端置于周围空洞（PVS）中。通过根据PVS的溶胀速度增加或减少注射压力来调节合适的注射流速。对于pCX-Flag 2-NLS 1-Sub-Cas9-NLS 2＆amp; 2＆gt;和2ng /μl，质粒DNA的浓度为6ng /μl，四个ppU6-sgRNA载体中的每一个（注2）
  
  图3.猪胚胎的原核显微注射。离心对于从猪胚胎中的光密度含量显示由箭头指示的原核是至关重要的。比例尺=20μm。
胚胎移植
1. 将CRISPR / Cas9质粒载体显微注射到原核后，通过手术方法通过移液管将20至30个胚胎转移到输卵管中：
  1. 在运行前，对所有接收者进行24小时禁食，免费使用水。
  2. 手术前20分钟，注射5毫克硫酸阿托品和400毫克Stresnil以分解唾液排泄物并分别镇静动物。
  3. 设置耳静脉导管，并用3M纸带固定i.v。注射Citosol保持麻醉，持续时间为40〜50分钟。
  4. 在操作台上加载并固定收件人。清洁他们的腹部皮肤，剃掉头发。然后用无菌衣服覆盖动物。
  5. 在最后2个^{nd 到3 ^{rd 乳头之间的linea alba上创建一个8-10厘米的窗口，拉出单侧的子宫角，输卵管和腹部外的卵巢，然后计算卵巢上的黄体数量。将子宫角的最大部分立即放回腹腔。保留剩余的上部子宫角，输卵管，漏斗和卵巢以进行胚胎移植（图4A）。}}
  6. 在通过口吸管控制的玻璃转移管中的D-PBS中加载10-15个胚胎并将胚胎转移到输卵管峡部（图4B）。
  7. 用含有硫酸肝素（50,000 U / L）的盐水冲洗子宫角，然后放回腹腔内。
  8. 在缝合切割窗口之前，将10ml的阿莫西林注入腹腔内。
  9. 胚胎移植后，通过连续缝合封闭腹壁腹壁和肌肉，并通过中断的垂直床垫缝合脂肪层和皮肤。
  10. 最后，注射10毫升阿莫西林在接下来的三天颈部，以防止感染。
    
    图4.胚胎移植 A.上部子宫角，子宫，输卵管，漏斗和卵巢保留在外面用于胚胎移植。 B.将胚胎装载在通过口吸管控制的玻璃管中，并转移到输卵管峡部（缩写：u为子宫，呃为子宫角，ft为输卵管，inf为漏斗）。 />
饲养和仔猪护理
1. 在预期交货日期前七天将母猪移至母猪。
2. 观察母猪的紧张和不安的行为;用手挤奶进一步检查哺乳期。
3. 在母猪开始哺乳的那一天，仔细检查母猪，确定其中任何一个需要帮助，并照顾新生儿。
4. 在分娩完成的第二天，收集仔猪的尾部组织样品进行DNA提取和进一步的基因组分析。

数据分析

从猪尾组织分离的基因组DNA样品通过使用表2所示引物的PCR进行分析。将PCR产物克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体中。对质粒的单个克隆进行测序以解释突变。在典型的实验（Chuang等人，2016）中，将41个原核微注射的胚胎转移到两个代孕母猪中。其中一只怀孕，7只小猪被送出。检测到两个创始人L537-12和L537-13在尾组织中携带GGTA1突变。 L537-12样品中显示野生型DNA序列和位点1处的4 bp（TTGG）缺失。在L537-13样品中鉴定出7 bp（TGGTTGG）缺失和另外7 bp（CATGGTT）缺失。在与野生型配子交叉后，在L537-12的14个后代中的5个中测量了4bp（TTGG）缺失。在L537-13的13个后代中，分别在5和3中检测到7 bp（TGGTTGG）和7 bp（CATGGTT）缺失。值得注意的是，在最近的13个后代中，一只仔猪携带了149bp的缺失（位点1和位点4之间的片段），这在创始人的尾部组织中没有被检测到。理论上，对于异源雄性，一半的精子是突变体。对于50％的马赛克男性，25％的精子是突变体。由于L537-12创始人14个后代中的5个携带了4 bp（GGTT）缺失，所以表明镶嵌率在50％到100％之间。由于L537-13创始人13个后代的5和3个分别携带7 bp（TGGTTGG）和7 bp（CATGGTT）缺失，因此也支持这一结论。携带149bp缺失的L537-13的其他后代表明缺失反应发生在4细胞胚胎期后。 L537-12和L537-13病例中大部分种系都可能被突变细胞的下降所占据。然而，这些数据也提供了一个线索，即CRISPR / Cas9质粒引起的GGTA1突变可能发生在猪合子的2细胞阶段之前和之中。

表2. PCR引物对

笔记

如果使用PAGE纯化引物，超过90％的分析克隆由正确序列组成。电子。大肠杆菌JM109感受态细胞常用于我们的实验室。
ppU6-GGTA1 38-60 -gRNA，ppU6-GGTA1 187-209 -gRNA，ppU6-GGTA1 181-159 的基因编辑效率首先用LLC-PK1细胞在细胞水平检查-gRNA和ppU6-GGTA1 223-201 -gRNA（分别位点1至位点4）（Su等人， em>，2015）。通过ppU6-GGTA1 187-209 -gRNA和ppU6-GGTA1 223-201-gRNA发现更高的效率。在这种原核显微注射实验中，共注射所有四种ppU6-GGTA1-gRNA载体;一致地，仅检测到位点1和位点4的indel突变

食谱

TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0
1mM EDTA，pH 8.0
TEN缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0
1mM EDTA，pH 8.0
0.5 M NaCl

致谢

这个协议是从我们最近的作品（Su <等人，2015; Chuang等人，2016）改编而成。我们要感谢参与这些作品的所有成员。这项工作得到NSC 101-2313-B-059-001授权给C.F.T.的支持。以及MOST 104-2321-B-886-002和MOST 105-2321-B-886-001至C.K.C.来自台湾科技部。