材料和试剂

培养皿（直径90mm）（Fisher Scientific）
泥炭苔，蛭石和珍珠岩（3：1：1，v/v/v;棉兰S.A.）
纸巾
使用聚四氟乙烯（PTFE）线帽（Dutscher，目录号：001031）的8ml玻璃管（Dutscher，目录号：065307B）
拟南芥花盆（聚苯乙烯，9 x 9 x 9.5厘米）（SOPARCO，目录号：4686）
带有盖帽的2 ml GC小瓶（Agilent Technologies，目录号：5182-0557）和400μl平底玻璃插件（Agilent Technologies，目录号：5181-3377）
拟南芥种子
95％乙醇
次氯酸钠（漂白剂）
蒸馏水
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：10315720）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：32211）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34885）
氮（H 2 O 3 O <3ppm; C H <0.5ppm; O 2< 3< ; 2ppm）
硫酸（H 2 SO 3 SO 4）（CARLO ERBA试剂，目录号：E410391）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
甲基叔丁基醚（MTBE）（Sigma-Aldrich，目录号：20256）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
具有1％三甲基氯硅烷（TMCS）的N，O - 双（三甲基甲硅烷基） - 三氟乙酰胺（BSTFA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6381）
庚烷（Sigma-Aldrich，目录号：32287）
甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：32249）
Murashige和Skoog培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M0222.0050）
维生素
植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001.1000）
2-（N-吗啉代） - 乙磺酸（MES）（Euromedex，目录号：EU0033-B）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：P5958）
内部标准：
十七烷酸（C17：0）（Sigma-Aldrich，目录号：H3500）
十五醇（C15：0-OH）（Sigma-Aldrich，目录号：412228）
ω-十五内酯（产生ω-OH-C15：0）（Sigma-Aldrich，目录号：W284009）
Murashige和Skoog（MS）培养基（见食谱）
库存溶液（5 mg/ml）内标（见配方）

设备

生长室（Fitotron，Weiss Technik）
一对剪刀（Holtex）和镊子（Hammacher）
干燥加热块（Fisher Scientific，目录号：FB15103）
Polytron（IKA，型号：T 25数字）
管旋转器（Cole-Parmer，Stuart，型号：SB3）
通风柜（Delagrave）
Dessicator（Nalgene）
离心机（Hettich Lab Technology，型号：ROTORFIX 32 A，最大6000RPM）
玻璃巴斯德移液管（例如，，VWR）
称重秤（Sartorius，型号：SECUR A124-1S）
连接氮气罐的温度控制蒸发器（Meyer N-Evap Organomation）
Agilent 6850（Agilent Technologies，型号：Agilent 6850）气相色谱仪配有HP-5MS色谱柱（长度30 m，标称为0.25 mm，膜厚为0.25μm）和Agilent 5975质谱检测仪（70 eV，质量均匀比例50-750）（或等效GC-MS）
pH计（Hanna Instruments，型号：Hi4222）
高压灭菌器

程序

植物生长和根系收获
1. 在Murishige和Skoog（MS）培养基的培养皿上，将拟南芥灭活的种子（95％乙醇中1分钟，漂白剂[6-14％次氯酸钠中15分钟，用无菌水洗涤6次）补充了0.7％琼脂和2.5mM MES，pH 5.7（参见食谱）。
2. 在4℃下将种子在黑暗中分层3至4天，并在22℃的温度下在长时间条件（16小时光照和8小时黑暗）下将板转移到受控环境生长室。种植幼苗长达4周。
3. 对于土壤种植的植物，将在MS培养基板上生长的2周龄的幼苗转移到含有预先润湿的泥炭苔藓 - 蛭石 - 珍珠岩（3:1:1，v/v/v）生长培养基（约700cm ³每盆）。五盆五盆。将盆在22°C放置在受环境温度控制的生长室中，环境湿度在长时间的条件下
4. 为了从组织培养生长的幼苗收集根，使用一把剪刀来消除幼苗的空中部分，从培养皿中取出整个琼脂培养基盘，并将其倒置在盘盖中。用镊子从琼脂中收集根。从琼脂培养基中收集后，不需要清洗根。
5. 为了从土壤种植的植物收集根，通过浸泡在水中小心地除去土壤生长介质，用一把剪刀将植物的其他部分的根分离，并用蒸馏水彻底冲洗根，尽可能地除去剩余的生长培养基。
非提取方法
1. 池根形成束根。进行4到5次重复。
2. 通过在纸巾之间按压材料（即，直到纸巾保持干燥），尽可能干燥根部。
3. 测量鲜重（FW）。对于拟南芥，每次重复需要5至25mg的FW根。
溶剂萃取法
1. 池根形成束根。
2. 用纸巾干根，测量鲜重（FW）。对于拟南芥，每次重复需要70至100毫克的FW根
3. 将新鲜收集的根放在含有4ml热（85℃）异丙醇的玻璃提取管中，并在85℃下在干燥加热块中孵育30分钟。冷却至室温后，当分析大根或大量材料时，用Polytron还原成细粉，以便有效脱脂。
4. 在残渣沉淀后，将异丙醇相转移到新的玻璃管中，并通过以下方式提取可溶性脂质进一步去除根部：
5. 在轮旋转40rpm的管旋转器上，在室温下进行所有去脂步骤24小时。在每个脱脂步骤之后，在相同的9ml玻璃管中收集溶剂级分，每次在温和的氮气流下每次还原新收集的溶剂，使得没有溶剂从管中溅出（但不完全干燥，从而最小化脂质的氧化）。最后，完全干燥所得到的合并的提取物，其对应于可溶性脂质部分，将其重悬于1ml氯仿/甲醇（1:1; [v:v]）中，并将其储存在4℃直至进一步分析如脂肪酰基链分析部分所述
6. 在用甲醇进行最终脱脂步骤后，将得到的溶剂提取的根材料在通风橱中在室温下干燥2-3天。这种脱脂的干燥残余物将含有苏木精聚合物。将含有脱脂根（无盖）的管放置在干燥器中另外2天，然后测量干燥残留物（DR）重量（通常为FW的10至15％）。
通过GC-MS进行脂肪酰基链分析
1. 加入1ml 5％（v/v）硫酸的甲醇，其中含有十五烷酸（C17：0），十五醇（C15：0-OH）和C15-羟基十五烷酸（ω-OH-C15：0）作为新鲜收集的根（非提取方法）的内标，或溶剂萃取的干燥残留物，或溶解脂质部分的五分之一（200μl）（溶剂萃取法）。
2. 紧闭管并在85℃下在干热加热块中孵育3小时，无需搅拌。该转甲基化步骤解聚苏木精聚合物，同时释放酰基链使其成为所有可溶性脂质。
3. 在室温下冷却后，向每个管中加入1ml NaCl（2.5％，w/v）和2.2ml甲基叔丁基醚（MTBE），并通过剧烈振荡混合。 >
4. 在室温下800g离心5分钟以允许相分离，并使用玻璃巴斯德移液管将上MTBE相转移到干净的玻璃管上。
5. 向MTBE相中加入1ml含有0.09％（w/v）NaCl的100mM Tris碱性pH 8.0，通过剧烈振荡混合，并在室温下以800xg离心5分钟以允许相分离。
6. 使用玻璃巴斯德吸管在干净的玻璃管中收集上MTBE相，避免任何水相（较低）相，并在温和的氮气流下蒸发MTBE。留下一些较高的MTBE相，比任何水相（下）相污染更好。
7. 加入100μl99％BSTFA（N，O-双（三甲基甲硅烷基） - 三氟乙酰胺），用1％TMCS，密闭管子，并在干燥加热块中在110℃温育15分钟，搅动。该步骤使游离羟基三甲基甲硅烷基化，使得含有这些基团的化合物更适合于气相色谱分离
8. 在室温下冷却后，在温和的氮气流下蒸发溶剂，并将产物溶于250μl庚烷：甲苯（1:1，v/v）中。
9. 将每个样品转移到含有玻璃插入物的GC小瓶中
10. 对于GC-MS分析，将1μl样品溶于庚烷：甲苯（1:1）中的样品以不分流模式注入。注射器的温度保持在250°C。柱温箱在50℃下保持1分钟，然后以每分钟25℃的速度从50℃升至200℃，然后保持1分钟，然后以一定速度再次升高为10℃/分钟，最终温度为320℃，保持8分钟。总运行时间为28分钟。高纯氦气用作载气，流速为每分钟1.5毫升

数据分析

总共（非提取方法），可溶性和聚合（溶剂萃取方法）在组织培养中生长的4周龄野生型幼苗的根的酰基链的典型色谱图如图1所示。

图1.组织培养中生长的4周龄野生型幼苗的根，总可溶性和聚合酰基链的代表性色谱图。所有主要单体的同一性（代表超过1％总量）按照洗脱顺序在左侧表格中显示。 X：Y代表X碳原子和Y不饱和的脂肪酸，X：Y-OH代表脂肪醇，X：Y-ωOH代表ω-羟基脂肪酸，X：Y-DCA代表二元脂肪酸和2OH -X：Y代表2-羟基脂肪酸。 IS代表内标：十五烷醇（C15OH），十七烷酸（C17）和15-羟基 - 十五烷酸（C15ωOH）。问号和星号分别表示不明的化合物和污染物
单体的定量是基于GC-MS色谱图中的峰面积，使用其保留时间确定，并使用各自内标的峰面积（脂肪酸和二羧酸为C17：0，ω-OH-C15：0为ω-羟基酸，C15：0-OH）。通过将内标（5μg）与感兴趣成分的峰面积乘以内标峰面积来计算成分量（μg）。将组分量除以根的鲜重（FW）或干残渣（DR），以分别获得非萃取和溶剂萃取方法中μg/mg FW或DR的值。
ubberin（包括聚合的以及可溶性酰基链，主要是脂质醇，以桧烯相关蜡的形式）的全球酰基链组成然后计算如下：

从非提取方法，苏维林含有所有二羧酸，ω-羟基酸和脂肪醇，但只有约3％的C16和C18脂肪酸（主要来自制备膜的脂质），20％ 0和22：0脂肪酸和25％超过C22的非常长链脂肪酸（因为ubberin富含非常长链脂肪酸，特别是20：0和22：0），如前所述（Delude > et al。，2016）。

从溶剂萃取法中，苏维林包含存在于聚合和可溶部分中的所有二羧酸，ω-羟基酸和脂肪醇，但仅包含聚合的脂肪酸。

根据两种方法在组织培养中生长的4周龄幼苗的根的全部酰基链组成如图2所示。

图2.收获了来自4周龄幼苗根的全部酰基链组成，并根据溶剂和非提取方法分析桧木脂肪组合物。 X：Y对于具有X碳原子和Y不饱和度的脂肪酸。收获来自4周龄幼苗的根，并根据溶剂和非提取方法分析桧木脂肪族组合物。在溶剂萃取方法中，测量根鲜重（FW）和干残渣重量（DR），表明DR为FW的约14％。这种相关性用于在非提取方法中以μg/mg DR计算ubberin组成

笔记

塑料软件不应在协议中的任何一点使用，否则塑料污染物可能会掩盖GC痕迹中的峰值。用氯仿预先冲洗所有玻璃器皿和汉密尔顿注射器三次。新型玻璃巴斯德移液器不需要进行溶剂冲洗。

食谱

Murashige和Skoog（MS）培养基（400 ml）
将1.8克MS与维生素，0.2克MES，2.8克琼脂混合在400毫升蒸馏水中用1N KOH（5.61g，在100ml水中）调节pH至5.7 在120℃高压灭菌20分钟，冷却，然后倒入培养皿（每碟20至25毫升）
库存溶液（5 mg/ml）的内部标准
储存溶液（5 mg/ml）内标（十七烷酸，C17：0;十五醇，C15：0-OH; C15-羟基十五酸，ω-OH-C15：0）应在甲醇中制备，并储存在玻璃管与聚四氟乙烯（PTFE）线帽在-20°C直到使用

致谢

这里描述的溶剂萃取方法改编自2016年11月的Delude等人。这项工作得到了法国自然资源研究所（CD）的博士研究生资助，由Natural加拿大科学与工程研究理事会（授予OR），授权号MetaboHUB-ANR-11-INBS-0010到波尔多代谢组织/脂质体平台的功能基因组中心。

参考

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