材料和试剂

提示（0.2μl至1,000μl）（VWR）
纸巾
血清学移液器单独包裹（从5毫升到50毫升）（奥林巴斯）
0.22微米过滤灭菌系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：567-0020）}
组织培养处理的多层烧瓶-T500cm 3双烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：132867）}
50ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：339652）}
真空连接巴斯德吸管
1.7ml微量离心管（Genesee Scientific，目录号：22-282）
铝箔
紫外线透明的平底96孔板（Corning，目录号：3635）
1 ml注射器（BD，目录号：309659）
石蜡膜（Bemis，Parafilm M ^®）
Whatman 1号滤纸（GE Healthcare，Whatman，目录号：10010155）
30 G½针
电子显微镜网格（电子显微镜科学，目录号：FCF2010-Ni）和清洁镊子操纵网格
网格存储盒（Electron Microscopy Sciences，目录号：71156）
鼠标（FVB/NJ）（杰克逊实验室，目录号：001800）
200瓶乙醇（Decon Labs，目录号：2805M）
胎牛血清（FBS）（Mediatech，目录号：35-010-CV）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190250）}
蛋白酶抑制剂鸡尾草储备液（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
Cy3标记或生物素化胆固醇结合的hsiRNA（内部生产）
与HsiRNA指导链（20个核苷酸长）完全互补的Cy3-OO-PNA链（PNA Bio）
肽 - 核酸（PNA）杂交测定（由Axolabs，Kulmbach，Germany开发）
RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：89900）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：25530049）}
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：S1252）
注意：本产品已停产。
戊二醛（Polysciences，目录号：01909-10）
Avertin（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
QuantiGene 2.0测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：QS0011）}
Quantigene 2.0 Probesets（由基因变化）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）
MSC培养基（ATCC，目录号：PCS-500-041）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
Tris碱（TRIZMA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
氢氧化钠（NaOH）（〜50ml NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：72068）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
乙腈（50％乙腈溶液，在蒸馏H 2 O中稀释）（Fisher Scientific，目录号：A998-4）
高氯酸钠一水合物（NaClO 4·xH 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S490-500）
甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M6385）
PFA粉末（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
乙酸铀酯（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
草酸
Tris-HCl（pH8.5）（Fisher Scientific，目录号：BP153）
氢氧化铵（NH 4 OH）（Fisher Scientific，目录号：A669-212）
细胞培养基（参见食谱）
1 M蔗糖（见食谱）
1M Tris-HCl（参见食谱）
0.5 M EDTA（参见食谱）
3 M KCl（见配方）
10％SDS（参见食谱）
0.1 M磷酸钠缓冲液（见配方）
HPLC缓冲液A（参见食谱）
HPLC缓冲液B（参见食谱）
戊二醛，1％（v/v）（参见食谱）
甲基纤维素，2％（w/v）（见配方）
2％和4％（w/v）的多聚甲醛（PFA）（见配方）
乙酸异丙酯（4％w/v），pH 4（参见食谱）
草酸铀酸盐，pH 7（参见食谱）
甲基纤维素-UU，pH4（参见食谱）

设备

组织文化罩
软刷
超离心机70毫升聚碳酸酯瓶（Beckman Coulter，目录号：355655）
固定角度Ti45超速离心机转子（Beckman Coulter，型号：45 Ti，目录号：339160）
冷冻超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XE）
冷藏式台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
0.5微升至1毫升的微量移液器（Labnet International，型号：BioPette ^Plus）
固定角度TLA-110转子（Beckman Coulter，型号：TLA-110，目录号：366735）
1.5ml微量离心机适配器（Beckman Coulter，目录号：360951）
冷藏台式超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^TM MAX-TL）
用于1.5 ml微管的轨道式热振动筛（Grant Instruments，型号：PHMT系列）
读卡器分光光度计（Tecan Trading，型号：Infinite ^® M1000 Pro）
立体镜框架（KOPF INSTRUMENTS，型号：963型）
带有自动进样器荧光检测器的HPLC系统（Agilent Technologies，型号：HPLC 1100系列）
汉密尔顿注射器（Hamilton，型号：Gastight＃1002）
细胞外囊泡大小分布和浓度读取器（Malvern Instruments，型号：NanoSight NS300）
细胞外囊泡电荷读数器（Malvern Instruments，型号：Zetasizer Nano NS）
玻璃微电泳比色杯Dip Cell kit（Malvern Instruments，目录号：ZEN1002）
透射电子显微镜（JEOL，型号：JEM-1011）
注意：本产品已停产。
渗透泵（DURECT，ALZET，目录号：1003D和1007D）
水浴37°C
Microscissors（Fine Science Tools，目录号：14060-10; 14002-12）
一套两个镊子（精细科学工具，目录号：11251-30）
Vibratome（Leica Biosystems，型号：Leica VT1000 S）
自动洗板机（BioTek Instruments，型号：ELx405）
组织培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heracell ^TM 150i）}
吸管（Drummond Scientific，型号：Portable Pipet-Aid ^® XP）
组织培养相差倒置显微镜（Motic，型号：AE2000）
阴离子交换柱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：DNAPac ^{TM，PA100）}}
热块（Fisher Scientific，型号：Isotemp ^TM 2050FS）
μPlate载体（Beckman Coulter，型号：SX4750）
-86℃冷冻机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Forma< sup>> 900系列）}
连接真空的生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：1300系列II类，A2型）}

软件

纳米粒子跟踪分析（NTA）软件
Microsoft Office Excel（Microsoft Pack Office）
GraphPad Prism 6软件（GraphPad Software，Inc.）

程序

细胞外囊泡的生产和净化
注意：
1. 细胞外囊泡的纯化如图1所示。
  
  图1.细胞外囊泡生产流程图：通过差速超速离心从条件培养基中纯化细胞外囊泡（微泡和外来体）
2. 涉及打开超速离心瓶的所有步骤必须在组织培养罩中进行。要对瓶子进行消毒，使用软刷子用肥皂清洗瓶子和盖子，并用无菌水冲洗干净，以清除任何痕量的肥皂。在组织培养罩中，将清洁的瓶子及其盖子在70％乙醇浴中灭菌，并在纸巾上在UV光下干燥以进行最终灭菌。聚碳酸酯瓶对乙醇和紫外线敏感，所以避免将瓶子放在70％乙醇中超过2分钟，紫外线超过30分钟。
3. 细胞外囊泡是透明的棕色，非常小，这使得它们难以检测。使用永久性标记，标记每个70毫升超速离心瓶的一侧以将瓶子定向在转子中，并指示在哪里寻找细胞外囊泡。所有70毫升瓶子都应满满瓶肩（约65毫升），以进行高速离心。否则瓶子会塌陷并损坏转子。如果没有填充到肩膀，用PBS完成体积。
1. 准备细胞外消化细胞的培养基和细胞培养物注意：细胞外囊泡天然存在于体液中，包括通常用于补充细胞培养基的胎牛血清（FBS）。因此，在任何使用之前，细胞外囊泡从其中纯化的细胞培养基通过过夜超速离心而耗尽血清 - 细胞外囊泡，以最小化污染。
2. 细胞外囊泡的生产和纯化
  注意：
  1. 通过改良自Thery等人的方法从条件培养基中纯化细胞外小泡。（2006）组合顺序离心和过滤步骤。所有细胞外囊泡质量控制按照国际细胞外囊泡学会推荐的实验要求进行（Lotvall等，2014; Thery et al。，2006）。
  2. 体内实验需要显着浓度的细胞外囊泡以进行有效的沉默。为了收集大量的细胞外囊泡，我们从培养物中粘附细胞的条件培养基中纯化细胞外囊泡。纯化细胞外囊泡的产量与培养基体积的增加有关。因此，为了产生大量的条件培养基并且扩大细胞外囊泡的浓度，我们使用T500cm 2的三烧瓶。
  1. 在多层烧瓶中，在常规推荐的培养基中生长感兴趣的贴壁细胞，直到它们达到70％至80％的汇合度。我们观察到，60毫升是可以用于T500厘米三重烧瓶的介质的最小体积。
  2. 将培养基倒入液体垃圾中，因为血清移液管不能用于从多层烧瓶中去除液体。使用50ml血清移液管，用相似体积的推荐的EV-贫血培养基更换培养基。
  3. 在37℃，5％CO 2和100％湿度下孵育细胞48小时。
  4. 收集培养基并进行细胞外囊泡纯化，如下。如果细胞不是100％融合，则用新鲜的细胞外消化细胞的培养基替换收集的培养基，孵育48小时，然后重复细胞外囊泡纯化。
  5. 将含有细胞外囊泡的培养基收集在50ml离心锥形管中
  6. 在室温下以300 x g离心10分钟，沉淀并除去浮游细胞和大碎片。
  7. 使用50ml血清移液管将上清液转移到新的50ml离心锥形管中。在管的底部留下2-3ml培养基，以避免干扰沉淀。丢弃颗粒。
  8. 将上清液以10,000 x g，4℃离心30分钟，以分离大泡囊或微泡。
  9. 通过真空连接的无菌0.22μm过滤器单元倒出并过滤消毒上清液，以进一步消除较大的囊泡。
    注意：含有微泡（300 nm至1μm）的10,000 g沉淀物是白色和粘稠的，可用于其他实验。如果需要微泡，则使用真空连接的巴斯德吸管将瓶子底部的残留介质完全去除。使用微量移液管将沉淀悬浮在1ml PBS中。沉淀物应与PBS的流动容易分离。将收集的微泡以10,000xg，4℃离心30分钟，作为另外的洗涤步骤，并将沉淀悬浮于100μlPBS中。
  10. 使用50ml血清移液管，将过滤的培养基转移到70ml聚碳酸酯瓶中。
    注意：用永久性标记标记瓶子，并将瓶子放置在离心机中，标记面向中心。这将有助于稍后本地化颗粒。
  11. 在预冷45型Ti转子中，超离心机在100,000 x g，4℃下至少70分钟。
  12. 使用真空连接的巴斯德吸管将所有瓶子的上清液完全吸出。
    注意：剩余的介质将落在瓶子的壁上，形成必须通过真空连接的巴斯德吸管吸出的最后一滴上清液。
  13. 检测瓶子底部的细胞外囊泡。颗粒的颜色为棕色透明，直径约5毫米。
    注意：颗粒将被定位到瓶子的标记侧。
  14. 为了浓缩细胞外囊泡，使用微量移液管将所有颗粒悬浮在相同的1ml PBS中。用尖端，刮擦球囊内和周围的瓶子，以恢复最大的细胞外囊泡。
  15. 将悬浮的颗粒转移到1.5ml微量离心管中。仔细回收在每个瓶底部形成的含细胞外小泡的PBS的剩余液滴
  16. 将1.5毫升的管子放入管子的预冷TLA-110转子中，并将管帽取向，找到沉淀物。
  17. 在桌面超速离心机中离心至少70分钟，以100,000 x g，4℃离心。
  18. 将沉淀重悬于100μlPBS，1x蛋白酶抑制剂混合物和10mM蔗糖中用于进一步的实验。储存于4°C进行短期使用，-80°C长期储存。避免反复冻融（见注2和3）。
    注意：对于蛋白质组学或脂质分析，将沉淀物保存在-80℃。
hsiRNA负载细胞外囊泡的制备和表征
1. 用hsiRNA载体细胞外囊泡用hsiRNA加载细胞外囊泡如图2所示。
  
  图2.外来体加载程序的流程图Cy3-hsiRNA和细胞外囊泡的共孵育导致通过超速离心沉淀的Cy3-hsiRNA胞外囊泡
2. 通过直接定量荧光标记的hsiRNA测定hsiRNA浓度使用两种方法来估计细胞外囊泡中hsiRNA的负载效率（图1）（见注释6和7）。首先，直接测量hsiRNA - 细胞外囊泡中的Cy3荧光。我们观察到细胞外囊泡可能会显示自身荧光信号，从而可能会混淆来自加载的hsiRNA的Cy3荧光的测量。因此，我们推荐第二个策略：计算最初添加到样品中的Cy3-hsiRNA的总量与上清液中剩余的Cy3-hsiRNA的量（未加载）与细胞外囊泡和超离心孵育之间的差异。为了确定hsiRNA的准确浓度，可以将准备阴性的对照（PBS只有没有hsiRNA）和hsiRNA的校准曲线制成紫外透明的平底96孔板的孔。通常在96孔板中使用的最小体积的样品是50μl。对于校准曲线，制备1：2稀释系列的hsiRNA，跨越量与加载到细胞外囊泡中的量相当。
3. 通过肽 - 核酸杂交分析测定hsiRNA浓度
  为了确认通过使用分光光度计测量Cy3荧光获得的hsiRNA的浓度，我们使用肽 - 核酸（PNA）杂交测定（由Axolabs，Kulmbach，Germany开发）确定样品中的hsiRNA引导链浓度（不是Cy3标记的））（Roehl等人，2011）。 PNA是DNA的单链类似物，糖 - 磷酸骨架被聚酰胺主链取代。因此，没有任何电荷，PNA以非常高的亲和力结合到它们的互补链上，形成双链DNA-RNA结构。 PNA测定是比分光光度法荧光测量更准确，但也更费力地测量颗粒中的hsiRNA浓度。此外，用于PNA测定的样品被裂解，不能在下游实验中使用。
  1. 在含有2mg/ml蛋白酶K的100μlRIPA缓冲液的1.5ml微量离心管中稀释hsiRNA-胞外囊泡样品。
  2. 超声处理15分钟，在室温下溶解囊泡
  3. 为了制备校准曲线，将已知量的hsiRNA双链体添加到裂解的胞外囊泡样品中
  4. 加入20μl3 M KCl，并用微量吸管轻轻混合，沉淀SDS（RIPA缓冲液组分）。
  5. 在室温下以5,000×g离心15分钟，以沉淀不溶性膜并沉淀SDS。
  6. 将含有hsiRNA引导链的清除的上清液转移到新的1.5ml微量离心管中。
  7. 稀释上清液以获得低于5pmol的hsiRNA /100μl样品的浓度。
  8. 加入完全互补于hsiRNA的引导链的Cy3标记的PNA链的5pmol（或超过加载到细胞外囊泡中的hsiRNA的量）的量，并与微量移液管轻轻混合。
  9. 为了将PNA链退火至hsiRNA指导链，在95℃孵育15分钟（以融合hsiRNA双链体），然后在50℃孵育（将PNA退火至hsiRNA引导链，取代有义链）15分钟，很酷到室温。
  10. 将样品转移到96孔板或与HPLC系统相容的小瓶中。
  11. 将含有PNA-hsiRNA指导链杂交体的样品注入HPLC阴离子交换柱，自动使用自动进样器或手动使用汉密尔顿注射器。用于流动相的缓冲液A和缓冲液B在食谱部分中有描述。根据您的HPLC系统和阴离子交换柱，优化10％缓冲液B至100％缓冲液B之间的梯度速度。方案的一个例子如表1所示。洗脱时间将由hsiRNA引导链的负电荷确定，不受中性PNA的影响。
  12. 读取550nm激发和570nm发射波长的Cy3荧光。信号来自PNA上的Cy3标签。整合对应于Cy3-PNA-hsiRNA引导链杂交体的峰。
  13. 使用校准曲线计算hsiRNA导向链浓度
    表1.描述Cy3-PNA-hsiRNA杂交浓度估计的HPLC标准操作程序的表
4. 细胞外囊泡大小分布和浓度的表征
  对于每个样品，通过记录和分析PBS中的颗粒的布朗运动并使用NanoSight NS300系统和纳米粒子跟踪分析（NTA）软件（参见注8）来确定囊泡的浓度和大小。
  1. 在1.5ml微量管中，在室温下，在1ml PBS（稀释比1:200至1:1000）中稀释1至5μl样品，并使用1ml微量移液管轻轻混合。
  2. 使用1 ml注射器将稀释样品注入NanoSight NS300系统。对每个样品使用新的干净的注射器。在注入新样品之前，先冲洗以前的样品，以清除囊泡中的管道。
  3. 调整相机快门并手动增益。要准确比较不同样品的浓度，请使用类似的相机快门和增益值
  4. 将样品一式两份监测30至60秒。
  5. 使用NTA软件处理录制的视频，以确定粒度和浓度。
  6. 通过将样品中hsiRNA的总量除以NTA检测到的细胞外囊泡数，假定正态分布，计算每个细胞外囊泡加载的hsiRNA数量。
5. 细胞外囊泡表面电荷的表征
  通过使用Zetasizer Nano的激光多普勒微电泳（DLM）测定hsiRNA-EV表面电荷。通过在样品上施加电场并测量样品中存在的颗粒的速度来获得颗粒电荷。颗粒的表面电荷与其速度直接相关。
  1. 在1.5ml微量管中，在1ml蒸馏的H 2 O（稀释比1:200至1:1000）中稀释1至5μl样品，并使用1ml微量移液管轻轻混合。我们注意到，在PBS中稀释样品会引起溶液的燃烧，导致误诊。
  2. 将稀释的样品转移到万能玻璃微电泳试管中。要求最小体积的700μl样品完全浸没电极。但是，不要过度填充反应杯，因为样品中会产生热梯度并降低测量精度。
  3. 缓慢地插入浸泡池，避免在样品和电极之间形成任何气泡。有关详细信息，请按照制造商推荐的步骤（ Zetasizer Nano配件指南）。每次测量之前，用蒸馏水彻底清洗Dip细胞电极。
  4. 按照制造商的说明创建标准操作程序（ Zetasizer Nano用户手册）。
  5. 一式两份地监控样本费用。
  6. 仪器给出了颗粒电荷的绝对值。我们观察到，hsiRNA负载的细胞外囊泡比非负载的细胞外囊泡具有更多的负电荷。
6. 通过电子显微镜分析细胞外囊泡和hsiRNA负载的细胞外囊泡完整性通过电子显微镜检测与细胞外囊泡结合的hsiRNA，我们使用生物素化的hsiRNA和链霉亲和素免疫金颗粒。用于电子显微镜的样品和网格在室温下制备，除非另有说明。
  1. 为了固定样品，将等体积的4％多聚甲醛加入到载有hsiRNA的胞外囊泡样品中并孵育2小时。例如，向50μl的hsiRNA-细胞外囊泡样品中加入50μl的4％多聚甲醛。
  2. 将3μl固定的hsiRNA-EV等分试样放入EM网格上
  3. 在干燥的环境中孵育20分钟使膜吸附。
  4. 要清洗网格，将100μlPBS放在一片石蜡膜上，并将网格上下颠倒转移到PBS一滴。
    注意：后续步骤类似地执行，将网格从一滴Parafilm的一滴试剂上下颠倒转移。
  5. 将网格转移到100微升的50mM甘氨酸/PBS中并孵育5分钟
  6. 将网格转移到100微升5％BSA/PBS中10分钟以阻止样品。
    注意：向试剂中加入0.1％的皂苷将使细胞外囊泡渗透，以检测任何腔内hsiRNA分子。
  7. 在100μlPBS滴下洗两次网格。
  8. 在存在或不存在0.1％皂角苷的情况下，将0.5μlBSA/PBS中以1:10至1:20稀释的5微升6-nm或10-nm链霉亲和素免疫金颗粒孵育1小时。
  9. 在100μlPBS滴中洗涤网格三次。
  10. 在1％戊二醛中孵育网格5分钟
  11. 在水中洗涤网格8次，每次洗涤2分钟。
  12. 将网格转移到草酸铀酰盐酸盐pH7中5分钟，以对比样品
  13. 将样品与1％甲基纤维素和4％乙酸双氧铀的9：1溶液对比并将其包埋在冰上10分钟。
  14. 用Whatman 1号滤纸去除多余的液体，让网格空气干燥5〜10分钟
  15. 观察60-80kV透射电子显微镜中的栅格
  16. 将电网在室温下存放在电网储存箱中。网格可以无限期存储。
用hsiRNA负载的细胞外囊泡治疗小鼠中枢神经系统
注意：所有的动物手术都是根据您的设施进行的。机构动物护理和使用委员会条例（IACUC）。为了验证目标mRNA在体内的hsiRNA - 细胞内小泡依赖性沉默，对照组包括用人造CSF，单独的细胞外小泡，hsiRNA和NTC - 细胞内小泡处理的小鼠和hsiRNA ^Target。（NTC：非定位控件）（见注9）。
1. 在大脑中进行任何治疗之前，通过腹膜内注射1.2％的Avertin将动物深度麻醉。
2. 将麻醉的老鼠置于立体定向框架中（见注10）。
3. 治疗3天或7天后，通过腹膜内注射1ml Avertin将小鼠安乐死。
4. 将鼠标放在其背面，用70％乙醇清洁腹部表面以对该区域进行消毒。
5. 使用微型剪刀，在腹部肌肉中进行垂直切口以打开小鼠腹腔。
6. 在小鼠的心脏中，仍然跳动，将针头连接到蠕动泵，将室温PBS注入5分钟，以从脑中除去血液。
7. 使用微型剪刀，将颈部的颅骨从颈部小心地切割到前额。仔细取出颅骨的两侧。
8. 使用大脑下方的镊子，小心地抬起头脑并从头骨中取出大脑
9. 相应地处理大脑以进一步实验。
10. mRNA在小鼠麻醉后不稳定并迅速降解。因此，对于准确的mRNA定量和评价体内沉默效率，收获后立即处理脑（Alterman等人，2015; Coles等人，2016; Didiot等人，2016）。根据制造商的说明书，使用vibratome，在-1至0.5℃的PBS中，在300μM冠状切片中切割大脑。 PBS的温度应稳定在0±0.2°C附近）。如果PBS的温度升高，则脑软化并变得更难切割。
11. 根据所治疗的大脑区域的大小，每只动物至少收集3个活组织检查，代表技术重复。大脑前部（嗅球）的第4个部分对应于纹状体的开始，这也是视觉上确认的。选择接下来的3个连续的冠状切片（5 ^th，6 ^th和7 ^th）来容易地从纹状体区域收集2mm活组织检查在小鼠脑中识别。活检的位置是严格固定的，并且样品总是从所有动物的脑的相同区域收集。
12. 根据Alterman等人，2015年的方法处理脑样品用于mRNA定量; Coles 等，2016; Didiot等，2016年。
13. 使用制造商协议（Affimetrix）推荐的使用QuantiGene 2.0测定法定量靶和对照mRNA。目标mRNA的总量总是归一化到控制管家的mRNA的数量（Coles等人，2016）（参见附注11）。

数据分析

数据使用Microsoft Office Excel进行处理，并使用GraphPad Prism 6软件进行分析。
使用QuantiGene bDNA测定法独立测量活组织检查中靶向和管家基因的水平。 3个技术重复的平均值代表每只动物的mRNA表达值（见注12和13）。

对于每个板和每个单独的探针组，平均在DLM（空白）孔中获得的值，并从所有样品孔中减去该平均值。
将目标基因发光值用管家基因发光值除以标准化靶基因表达
平均归一化未处理的细胞值。
将每个单独的标准化除以未处理孔的平均值，并乘以100，以计算相对于未处理细胞的靶基因表达的百分比。
如果化合物在复制中进行测试，则平均复制并计算标准偏差
对于剂量反应分析，使用非线性回归曲线拟合，log（抑制剂）对响应 - 可变斜率（四个参数）的图表浓度依赖性IC 50 曲线。如果需要，将曲线的下限设置为零，曲线上限为100.
使用GraphPad Prism软件中的标准包进行静态实验的体内统计分析。比较目标序列与非靶向对照（NTC）的功效以确定统计学显着性。与NTC组相比，所有比较的差异被认为在P - 值小于0.05的显着性。
当单次进行注射或输注时，仅进行分析，比较同侧或对侧值组（仅人工CSF，胞外囊泡，hsiRNA ^靶标和hsiRNA ^靶 - 细胞内囊泡）到hsiRNA - 细胞内囊泡组。

笔记

在进行超速离心以使细胞外小泡耗尽的培养基或纯化细胞外小泡或hsiRNA负载的细胞外囊泡之后，重要的是快速去除上清液以避免沉淀物溶解回上清液。
我们发现，最好在体外实验中为每个功能性体外制备新鲜的细胞外囊泡。
在任何功能测定前，将纯化的细胞外囊泡保持在4℃最多48小时
应特别注意hsiRNA修饰模式。功能有效的hsiRNA，负载或不在胞外囊泡，需要广泛的化学稳定。用2'-O-甲基和2'-氟进行核糖的化学修饰导致hsiRNA对核酸酶降解的抗性的显着增加，在体内提供更高的稳定性和//B>（Byrne等人，2013））。未修饰或部分修饰的hsiRNA将经历影响hsiRNA-细胞外囊泡功能功效的核酸酶降解。核细胞可能存在于从细胞培养基中纯化的胞外囊泡样品中
我们注意到，从不同细胞来源（例如，胶质母细胞瘤，间充质干细胞或脐带来源的细胞外囊泡）纯化的细胞外囊泡显示出与hsiRNA相似的载体能力。
用hsiRNA负载细胞外囊泡可饱和，每个囊泡最多装载约3,000-5,000个hsiRNA。然而，使用较高浓度的hsiRNA的细胞外囊泡的孵育稍微增加每个细胞外囊泡的hsiRNA的数量。随着hsiRNA /囊泡负载率的增加，表面负电荷略有增加，表明hsiRNA与囊泡膜结合。因此，太多的负载可能会干扰天然胞外囊泡细胞摄取机制
胆固醇结合的hsiRNA与细胞外囊泡的共孵育为化学合成的寡核苷酸加载细胞外囊泡提供了鲁棒，有效和高度可重复的方法。我们观察到胆固醇对于加载而言非常重要，因为非胆固醇结合的hsiRNA与细胞外囊泡无关（Coles等人，2016）。我们使用相同的程序来加载细胞外囊泡，其中siRNA与各种疏水部分缀合（例如，DHA）。我们观察到缀合物越疏水，加载效率越高（数据未公布）。
通过Bradford测定法测定纯化的细胞外囊泡的蛋白质浓度代表了量子化细胞外囊泡的另外可重复的方法。
hsiRNA ，靶向Huntingtin 基因和hsiRNA （NTC：用于开发该方法的非靶向对照在我们的实验室中设计和合成（Alterman等人，2015）。 hsiRNA 沉默效率在小鼠脑中没有或加载到细胞外囊泡中被证实（Coles等人，2016）。
通过立体定位手术进行Bollus注射和装载有hsiRNA-细胞外囊泡样品的泵。立体定向手术允许优化的时空控制小鼠脑中寡核苷酸治疗的优化递送;基本上任何选择的脑区域都可以针对任何产后发育阶段直到成年期的任何基因沉默。这种清洁和高度可重现的方法使其成为在脑中递送治疗剂的有吸引力的方法。 2只小鼠可以在2小时内完成整个手术。
hsiRNA负载的细胞外囊泡是稳定的，并且加载的hsiRNA对核酸酶具有抗性。然而，只有一部分加载的hsiRNA被内化到囊泡腔中，另一部分与外膜相关联。在这一点上，我们不能定义细胞外囊泡相关的寡核苷酸（表面结合或内化）在功能上是活跃的。进一步的研究对于确定负载hsiRNA的胞外囊泡的最佳载量，长期稳定性和体内的行为至关重要。
基于初步数据，从动物到动物的靶mRNA表达变化水平具有〜15％的误差，理论上要求n = 8动物能够以80％置信度检测20-30％的基因调控。对于使用基于泵的输注的hsiRNA-细胞外囊泡样品效能的体内验证，小鼠组用n = 8至n = 10只小鼠供电。
泵植入需要大量的手术，这可能导致手术过程中动物死亡不受控制，并说明不同组别的动物数量的差异。

食谱

注意：对于所有食谱，并且在本步骤的任何步骤中使用Milli-Q纯化水。

细胞培养基
注意：补充有FBS和抗生素的推荐培养基。
1 M蔗糖
将34.23g蔗糖溶解在100ml蒸馏水中的二氧化碳用0.22μm注射器过滤器过滤消毒，并在4°C下储存
1M Tris-HCl

将121g Tris碱（TRIZMA）溶解在700ml蒸馏水中的二氧化O /
用HCl将pH调节至8.5
用蒸馏水H 2填充至体积1升
通过高压灭菌灭菌并在室温下储存

0.5 M EDTA

在800ml蒸馏的H 2 O 2中加入186.1g EDTA
用NaOH（〜50 ml NaOH）调节pH至8
使用蒸馏H 2将O体积调节至1升
混合磁力搅拌器
通过高压灭菌灭菌并在室温下储存

3 M KCl
将22.368g KCl溶于100ml蒸馏水中，并彻底混合，
10％SDS
将10g SDS溶解在80ml蒸馏的H 2 O中。用蒸馏水将体积调整至100ml
0.1M磷酸钠缓冲液
溶解3.1g NaH 2 PO 4·H 2 O和10.9g Na 2 HPO 3， 4（无水）至蒸馏的H 2 O，使体积为1L。该缓冲液可以在4℃下储存长达1个月
HPLC缓冲液A
50v/v％乙腈，50v/v％水，含有25mM Tris-HCl（pH8.5）和1mM EDTA水溶液
HPLC缓冲液B
缓冲液A含有800mM NaClO 4
戊二醛，1％（v/v）
在0.1M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中稀释EM级戊二醛固定剂（以8％，25％或70％水溶液Sigma-Aldrich商购）至合适的稀释液。在-20°C下储存6个月或在解冻后在4°C下储存最多1周注意：用于制备固定剂的缓冲液需要具有良好的缓冲能力，以在固定期间保持约7.4的pH。
甲基纤维素，2％（w/v）