材料和试剂

细胞培养处理的聚苯乙烯24孔板（Sumitomo Bakelite，目录号：MS-80240Z）
100毫米盘（TPP，目录号：93100）
15毫升和1.5毫升管子
200微升移液管吸头
CHO-K1细胞（ECACC，目录号：85051005）
目标AID向量
nCas9-PmCDA1（Addgene，目录号：79617）
nCas9-PmCDA1-UGI（Addgene，catalog number：79620）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31985070）}
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11668019）}
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Nacalai Tesque，目录号：14249-24）
NucleoSpin Tissue XS（MACHEREY-NAGEL，目录号：740901.50）
一对引物扩增靶基因组区域加上150-200bp的上游和下游序列（对于HPRT靶1，Fw：5'-GGCTACATAGAGGGATCCTGTGTCA-3'; Rev：5'-ACAGTAGCTCTTCAGTCTGATAAAA-3' ）（Eurofin基因组学）
KOD FX Neo（TOYOBO，目录号：KFX-201）
凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
（可选）用于Illumina的NEBNext Multiplex Oligos（双指数引物Set1）（New England Biolabs，目录号：E7600S）
（可选）MiSeq试剂盒v3（Illumina，目录号：MS-102-3003）
Ham's F12培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ，目录号：11765054）}
胎牛血清（FBS）（Biosera，目录号：FB-1360/500）
青霉素 - 链霉素（Nacalai Tesque，目录号：26253-84）
G418
胰蛋白酶-EDTA，0.25％（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
（可选）6-TG
Ham's F12培养基（见食谱）
Ham's F12-G418培养基（参见食谱）
胰蛋白酶-EDTA 0.025％（参见食谱）
（可选）Ham's F12-G418-6-TG培养基（参见食谱）

设备

细胞培养箱37℃，5％CO 2（Panasonic，目录号：KMCC17RU2J）或等效物
微量移液器
具有10x目镜和10x物镜（Olympus，型号：CKX41）或等效物的光学显微镜
细胞计数板（WAKENBTECH，目录号：OC-C-S02）
离心机（最大速度：15,000rpm;最大RCF：21,380xg; 24×1.5 / 2.0ml角转子; 12×15ml摆出转子）（KUBOTA，型号：3740）或等效物/>
加热块（TAITEC，型号：CTU-Mini，目录号：0063288-000）或等效物
PCR热循环仪（TaKaRa Bio，型号：TP600）或等效物
琼脂糖凝胶电泳系统
3130xL遗传分析仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，型号：3130xL Genetic Analyzer）或等效物}

软件

CLC基因组工作台7.0

程序

本协议中描述的Target-AID过程的示意图概述可以在图2中找到。

图2. Target-AID载体和实验流程的示意图。载体构建体显示在顶部。将新霉素抗性基因（ ^{）插入到2A肽的下游，以确保融合蛋白在G418选择的细胞中的表达。可以使用Apa I和Spe I限制酶位点进行消化和连接来代替gRNA表达盒。用于靶向HPRT 基因的实验流程在底部示出。本实验分为三个步骤：（A）转染选择; （B）单细胞集落分离，（C）突变分析。由于HPRT将嘌呤类似物6-硫鸟嘌呤（6-TG）转化为有毒的衍生物，HPRT基因破坏赋予6-TG抗性，并且可以被反选择（ > HPRT 基因突变测定）。}

靶向AID质粒转染CHO-K1细胞
1. 将平板0.5×10 5 CHO细胞倒入500μlHam's F12培养基（参见食谱）中的24孔板中，并在37℃下用加湿的5％CO 2培养2小时气氛24小时。细胞在转染时约70-80％汇合。对每种细胞类型使用适当的培养基和培养条件
2. 将每个Target-AID质粒的1.5μg（2-5μl溶液）加入到50μlOpti-MEM培养基中并轻轻混合。
3. 在单独的管中，每个样品加入3μlLipofectamine 2000至47μlOpti-MEM培养基，并轻轻混匀。
4. 将Lipofectamine / Opti-MEM混合物（50μl，从步骤A3）加入到每个质粒/ Opti-MEM混合物（50μl+质粒;来自步骤A2）中并轻轻混合。在室温下孵育20分钟
5. 从步骤A1中取出24孔板培养物的Ham's F12培养基，并用1x PBS轻轻洗涤贴壁细胞。重复此洗涤过程两次，并为每个孔添加500μlOpti-MEM。
6. 使用微量移液管，将质粒 - 脂质体溶液（约100μl，从步骤A4）滴入每个孔中以均匀分布溶液。对于瞬时测定（可选），请执行步骤A10。
7. 在37℃下用5％CO 2孵育转染的细胞5小时，然后如步骤A5所述在洗涤程序后用Ham's F12-G418培养基（参见食谱）代替培养基。 br />
8. 在37℃，5％CO 2条件下孵育细胞5-7天。每3天更换新鲜的火腿F12-G418。对于脉冲孵育（可选），参见步骤A9。
9. （可选）转染后24小时，将培养板转移至25℃，5％CO 2条件，孵育24 h，37℃孵育48 h。重复此过程两次。预计这种方法可以提高突变效率，因为来自海盏花的PmCDA1可能适应于较低的温度（Nishida等，2016）。
10. （可选）在37℃下用5％CO 2孵育转染细胞5小时，并用不含G418培养基的Ham's F12替换培养基。 3天后，从细胞中提取基因组，并通过下一代测序仪（NGS）分析突变效率（参见步骤B5和C1-C6）。该分析可以检测瞬时Target-AID表达诱变。
拾取单细胞克隆
1. 转染后5〜7天，用1×PBS洗涤细胞，加入500μl的0.025％胰蛋白酶-EDTA（参见食谱）。在37℃下用5％CO 2孵育板2分钟。
2. 上下移动去除贴壁细胞，并将胰蛋白酶处理的细胞转移到1.5ml管中。加入500μlHam's F12-G418培养基以停止反应。
3. 将细胞以1,500 x g离心1分钟。
4. 除去上清液，并用100μlHam's F12-G418培养基重悬细胞沉淀。彻底上下移液以获得单细胞悬浮液。使用细胞计数板，检查单细胞悬浮液并计数细胞。将终浓度调至1×10 3 / ml。
5. （可选）如Nishida等人，2016（参见步骤C6）所述，将样品等分用于整个群体的深度测序分析。
6. 每100毫升含有7毫升Ham's F12-G418培养基的培养基中加入100微升单细胞悬液，并轻轻混匀。根据需要进行复制至少三次进行统计分析。突变效率将通过适当的统计分析来分析，例如Student's t检验。（可选）为了反选择HPRT - 单元格，请在100毫升含有7毫升Ham's F12-G418-6-TG培养基的培养皿中加入100-300μl单细胞悬液（参见食谱）并轻轻混合。制备具有不同浓度细胞的板，因为存活率可能因目标而异。 HPRT 基因破坏的效率将通过对G418耐药菌落的6-TG抗性菌落的比率来估计。在37℃下用5％CO 2孵育该板。
7. 培养5-10天后，菌落应该在盘子上可见。
8. 取出培养基，然后用200μl移液器吸头取出单个菌落，并将菌落转移到含有Ham's F12培养基G418的24孔板的孔中。单细胞提取可以通过典型的方法进行，如胰蛋白酶消化和连续稀释法
9. 在37℃下用5％CO 2孵育超过一周，直到克隆在24孔板中融合70-80％。
诱导突变的DNA测序分析
1. 使用NucleoSpin Tissue XS根据制造商的说明书提取基因组DNA。
2. 使用KOD FX Neo聚合酶根据制造商的说明书，使用引物（参见“材料和试剂”）在靶位点每侧两侧约200bp进行PCR。
3. 通过凝胶电泳检查PCR产物
4. 使用QIAGEN凝胶提取试剂盒根据制造商的说明书分离和纯化产品。
5. 使用3130xL遗传分析仪，对DNA进行序列分析并确定Target-AID诱导的突变（图3）。
6. （可选）为了检测小突变并获得全面的突变谱，可以应用NGS的深度测序。通过使用提取的基因组DNA，使用位于约500bp区域侧翼的一对引物进行第一次PCR，靶位点在中心。检查并纯化琼脂糖凝胶上的PCR产物（参见步骤C3-C4）。使用第一PCR产物作为模板，使用含有衔接子序列（Fw，5'-TCTTTCCCTACACCGACGCTCTTCCGATCT-（正向目标特异性序列）-3'; Rev，5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-（反向靶特异性序列）的引物进行第二嵌套PCR ）-3'），以扩增包含靶中心位点的衔接子加成扩增子（〜300bp）片段。根据制造商的说明书，使用NEBNext Multiplex Oligos进行Illumina测序，将片段标记为索引序列。使用MiSeq系统进行深度序列分析以获得成对的300bp长度和>根据制造商的说明，平均每个样本100,000次读数。
  
  图3.由Target-AID诱导的代表性突变比对用nCas9（D10A）-PmCDA1（79619）载体转染诱导的突变不仅包含核苷酸取代，而且还包含特异性插入和缺失。当使用表达nCas9-UGI融合的载体（79620）时，突变更可能是C至T取代。包括插入，缺失和点突变的突变显示为红色。

数据分析

使用CLC基因组工作台7.0的数据分析被描述为“西ida ida of of of of of of of of of of of of of of of of and and。。。。。。。。。。。”。

笔记

有单个细胞克隆的各种方法。应使用每种细胞类型的最佳方案。
通过改变反义链上的胞嘧啶，可以将靶向的鸟嘌呤替换为有义链。

食谱

Ham's F12培养基
Ham's F12补充10％FBS和100μg/ ml青霉素 - 链霉素
Ham's F12-G418培养基
补充有10％FBS，100μg/ ml青霉素 - 链霉素和125μg/ ml G418的Ham's F12
胰蛋白酶-EDTA 0.025％
胰蛋白酶-EDTA 0.25％用D-PBS稀释10倍
（可选）Ham's F12-G418-6-TG培养基
补充有10％FBS，100μg/ ml青霉素 - 链霉素，125μg/ ml G418和5μg/ ml 6-TG的Ham's F12

致谢

该协议最初作为Nishida等人的一部分发布，2016年。这项工作得到了药物发现和生命科学研究平台项目（药物发现，信息学和结构生命平台）的支持科学）从日本医学研究和发展机构（AMED）。这项工作还得到了日本教育，文化，体育和科技部（MEXT）促进科技特别协调基金，创建先进跨学科研究领域创新中心（创新生物生产神户）的支持。跨部门战略创新推进计划; JSPS KAKENHI [授权号26119710,16K14654及15K18647];新能源和工业技术开发组织（NEDO）和跨部门战略创新促进计划（SIP）。

参考

Cox，DB，Platt，RJ和Zhang，F。（2015）。治疗性基因组编辑：前景和挑战。 Nat Med 21（2）：121-131。

Komor，AC，Kim，YB，Packer，MS，Zuris，JA和Liu，DR（2016）。＆nbsp; 可编辑基因组DNA中没有双链DNA切割的靶基因。 533（7603）：420-424。 />

Nishida，K.，Arazoe，T.，Yachie，N.，Banno，S.，Kakimoto，M.，Tabata，M.，Mochizuki，M.，Miyabe，A.，Araki，M.，Hara，KY，Shimatani Z. and Kondo，A。（2016）。使用混合原核和脊椎动物适应性免疫系统的靶向核苷酸编辑。科学 353（6305）。

Shimatani，Z.，Kashojiya，S.，Takayama，M.，Terada，R.，Arazoe，T.，Ishii，H.，Teramura，H.，Yamamoto，T.，Komatsu，H.，Miura， Ezura，H.，Nishida，K.，Ariizumi，T.and Kondo，A.（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 28346401“target =”_ blank“>使用CRISPR-Cas9胞苷脱氨酶融合物在水稻和番茄中进行目标基因编辑。生物技术<35>（5）：441-443。 br />