材料和试剂

移液器吸头2-200μlEppendorf ^® epT.I.P.S. （Eppendorf，目录号：022492039）
移液器吸头50-1,000μlEppendorf ^® epT.I.P.S. （Eppendorf，目录号：022492055）
培养皿60 x 15 mm 500/cs（Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
培养皿35 x 10 mm 500/cs（Fisher Scientific，目录号：FB0875711YZ）
Corning ^® 15ml离心管（Corning，目录号：430791）
Eppendorf ^® Safe-Lock 1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）
牙签
99.95％铂，0.05％铱丝（3ft/pk）（Tritech Research，目录号：PT-9901）
OP50 E。大肠杆菌细菌（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传学中心，MN）
实验和控制。线虫菌株（明尼苏达大学，线虫，遗传学中心，MN）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
细菌蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211677）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
次氯酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：13440）
商业漂白剂60克/升（DROGUERÍAINDUSTRIAL SAN JUAN， http://www.sanjuandrogueria.com ）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
Luria肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
用琼脂培养肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
磷酸氢二钾（K 2/2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P2222）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
盐酸左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L0380000）
线虫生长培养基（NGM）（见食谱）
M9缓冲区（见配方）
5 mg/ml胆固醇（见食谱）
1 M MgSO 4（参见食谱）
1 M CaCl 2 （见配方）
磷酸盐缓冲液（见配方）
1 N NaOH（参见食谱）
25mM左旋咪唑（参见食谱）

设备

锥形瓶（Fisher Scientific，目录号：FB5006000）
Pipetor（Gilson，目录号：F167300）
蠕虫选择可以购买蠕虫选择（Genesee Scientific，目录号：59-AWP），或者在实验室中制作，如Wollenberg等人，2013所述。
巴斯德玻璃移液器（Fisher Scientific，目录号：22-378893）
高压灭菌器（Tuttnauerusa，型号：6690）
搅拌电热板（康宁，目录号：6795-620）
离心机（Eppendorf，型号：5430）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
颗粒杵（Kimble Chase生命科学研究产品，目录号：7495211590）
冷藏培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heratherm ^TM General Protocol Microbiological Incubators，catalog number：51028064）}
本生灯（Humbolt，目录编号：H-5870）
解剖立体显微镜（Olympus，型号：SMZ645）
温度稳定的孵化器（AQUA ^® LYTIC培养箱20°C）
冷冻机（-20°C;低温环境设备）（西门子，型号：C85-22）
水浴

程序

准备同步的线虫群体
1. 对于NGM板的制备，将3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨和17g琼脂混合在锥形瓶中。加入1L dH 2 O。高压灭菌121°C 20分钟。在55℃水浴中冷却烧瓶15分钟。加入1ml 1M CaCl 2，1ml 5mg/ml胆固醇的乙醇溶液，1ml 1M MgSO 4和25ml 1M KPO 4，（磷酸盐）缓冲液（参见食谱）。旋转混匀。使用无菌方法将NGM溶液分配到60×15mm培养皿中。填充2/3满的琼脂。
2. 选择10名年轻成年人到E。大肠杆菌 OP50接种60mm NGM板（参见食谱）。允许蠕虫生长2-3天，以确保至少100只妊娠成虫和足够数量的鸡蛋在板上。
3. 一旦达到这个蠕虫数，将3毫升M9缓冲液（见食谱）倒入盘子上，轻轻地旋转，以便除虫。再次使用2 ml M9缓冲液重复此过程。一块板足以漂白。
4. 使用移液管将蠕虫转移到15 ml锥形管中
5. 离心约252分钟离心约1分钟，以使颗粒蠕动。
6. 吸引大多数M9，而不会干扰蠕虫颗粒。
7. 将约1ml 3％次氯酸盐溶液和2.5ml 1N NaOH（见食谱）加入管中。
8. 旋转管约5分钟，直到看到完整的成年蠕虫数量减少。不要比这更长时间漂白，否则你会杀死鸡蛋。
9. 一旦大部分物体溶解，通过加入M9缓冲液中和碱性次氯酸盐，直到15ml锥形管，并以252×g离心1分钟。
10. 吸出大部分上清液，不会干扰蛋沉淀。
11. 将约15ml的M9加入管中，并充分混合
12. 再次离心在252 x g 1分钟。
13. 吸引大部分M9而不打扰蛋沉淀。
14. 再次重复步骤A11-A13。
15. 加入约5ml新鲜的M9并搅拌以重悬富含蛋白的颗粒。在室温下用温和的摇臂搅拌器孵育过夜。鸡蛋会孵化，动物将被捕获为饥饿的L1幼虫。
16. 将100和200个饥饿的L1幼虫转移到具有E的60mm NGM板上。大肠杆菌OP50细胞（每板1×10 5个细胞）或孢子（每个板1×10 5个孢子）（见注2） > B中。枯草芽孢杆菌菌株，并允许蠕虫生长2天，直到达到L4 /成人阶段
制备肠道细菌计数的线虫样品
1. 使用眉毛，并在M9缓冲液中收集50只成年动物的1.5 ml管（见注1）
2. 在样品制备过程中使用与每种细菌菌株相同数量的动物（蠕虫）
3. 用0.25mM左旋咪唑处理蠕虫，引起瘫痪
4. 用3％商业漂白剂表面灭菌5分钟（见注5）
5. 用M9缓冲液洗涤至少三次。
6. 蠕虫表面消毒后，使用颗粒杵和1％Triton X-100破坏外部细菌的蠕虫（见附注6）。
7. 以14,800 x g离心10分钟，取出上清液，将每个管的沉淀重悬于500μlM9缓冲液中（见注4）。
样品稀释液的制备（图1）
1. 要开始该步骤，取50μl细胞悬液，加入450μl去离子水。摇匀悬挂，标签为'10 ^-1'。
2. 在样品沉降之前，用无菌移液管取出50μl细胞悬浮液，并将其转移到450μl去离子水中。旋转样品，并标记为'10 ^-2'。
3. 重复该稀释步骤，使用50μl先前的悬浮液和450μl去离子水空白。将这些顺序标记为管'10 ^-3'。
  
  图1.如何制备细菌稀释的图。初始培养物的连续稀释以获得初始样品浓度的1/10，1/100和1/100的溶液（10 < sup> -1 ，10 ^-2和10 ^-3稀释液）。对于每种稀释液，管最初在其中含有450μl的水，使得在加入50μl培养物后，最终体积将为500μl。
制作扩散板用于细菌培养
1. 从分离大肠杆菌的蠕虫肠获得细菌菌落和营养B。（参见图2A），取三个LB琼脂平板（参见注3），并将其标记为A，B和C.涡旋样品10 ^{，10 ²和10 ^-3，并将50μl移液到每个平板上。这进一步增加了稀释值10倍（A = 10 ^-2，B = 10 ^-3，C = 10 ^{-4 ^{）（见图1）
  
  图2.显微照片显示枯草芽孢杆菌的营养细胞（A）和孢子（B）。条尺寸= 5μm。}}}
2. 接下来，将玻璃吊具浸入乙醇中。将吊具放在火焰中几秒钟以点燃和燃烧乙醇。这将对吊具进行消毒。
3. 将吊具放在第一块板上方，直到火焰熄灭。快速打开盖子，靠近盖子。将接触器上的琼脂（接种物=用于开始培养的细胞）放在琼脂上，然后将琼脂接种到琼脂表面附近，直到痕量的游离液体消失。
4. 重新点燃撒布机，并用下一个板块重复该过程，迅速工作，以免污染带有空气中的生物体的琼脂。
5. 将细菌板在37℃孵育16-18小时。在孵化期间确保板倒置，以防止水分从冷凝水滴落到琼脂表面上
制作扩散板用于孢子文化
1. 用B进行热处理。在80℃下标记为10 ^{-1 ^{，10 ^-2和10 ^-3 20分钟的枯草芽孢杆菌样品杀死营养细胞。漩涡样品（参见图2B），并将50μl移液到每个平板上。这进一步增加了稀释值10倍（A = 10 ^-2，B = 10 ^-3，C = 10 ^{-4 ^）。}}}
2. 接下来，将玻璃吊具浸入乙醇中。将吊具放在火焰中几秒钟以点燃和燃烧乙醇。这将对吊具进行消毒。
3. 将吊具放在第一块板上方，直到火焰熄灭。快速打开盖子，靠近盖子。将撒布机从接种物上接触琼脂，以冷却，然后将接种物滴在琼脂表面附近，直到痕量的游离液体消失。
4. 重新点燃撒布机，并用下一个板块重复该过程，迅速工作，以免污染带有空气中的生物体的琼脂。
5. 将细菌板在37℃孵育16-18小时。在孵化期间确保板倒置，以防止水分从冷凝水滴落到琼脂表面上
细菌计数
1. 孵化后，仔细检查所有细菌盘，并注意菌落大小和形状的差异
2. 计数并记录细菌菌落的数量。只计算和使用计算，盘每30-300个殖民地每板。每个板块下方的30个菌落不具有统计学意义，而每盘高于300个菌落的数量难以计数，并且可能由多个细胞产生菌落。
3. CFU /蠕虫的数量计算如下：
  板中CFU /蠕虫数A =（菌落数x 10 ²）/50
  板块CFU /蠕虫数B =（菌落数×10 ³）/50
  盘中CFU /蠕虫数C =（菌落数×10 ⁴）/50

数据分析

对于每个菌株或病症，使用至少50-100只动物获得更准确的结果
对于每个实验，应对每个菌株和条件检查相同数量的线虫。
每个测定应该运行一式三份，重复至少三次（Duveau和Felix，2012）
使用学生的 t 测试，具有 P 的重要性截止级别0.05用于两组之间的比较
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行多次比较。

笔记

拿一个牙签，将眉毛粘在头上。让它在室温下干燥。然后，使用此工具选择线虫。在使用眉毛之前，请用乙醇对其进行消毒
为了获得纯净的孢子，将经热处理的培养物（80℃下杀灭水浴中的营养细胞20分钟）用溶菌酶处理三次，每次用冷水洗涤并离心至100％的培养物为相-bright孢子。
对于用于种子枯草芽孢杆菌的LB板，我们强烈建议在45℃干燥20分钟或37℃40分钟，然后将稀释液放在每个板上以避免滑动的这种细菌在固体表面与冷凝水滴
应立即使用样品或在-20°C储存1周。
为了表面消毒，将50个蠕虫重悬于500μlM9缓冲液中，加入0.25mM左旋咪唑（5μl25mM左旋咪唑储备溶液）和3％商业Bleach（储备溶液）。通过轻轻倒置混合样品15分钟。然后用M9缓冲液清洗蠕虫至少3次。
蠕虫表面灭菌后，将200μl蠕虫悬浮液倒入1.5 ml微量离心管中的M9缓冲液中。加入选择的提取溶液（1％Triton X-100），杵用于研磨样品10次，或直至获得乳白色至黄色悬浮液。离心后，细胞碎片和细菌牢固地保留在锥形管的底部，上清液很容易吸出。

食谱

线虫生长培养基（NGM）
将3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨和17g琼脂溶解在1L dH 2 O中，高压灭菌器
在室温下存放
M9缓冲区
将5g NaCl，6g Na 2 HPO 4和3g KH 2 PO 4溶解至1L的dH ₂ O
高压灭菌器
在室温下存放
5 mg/ml胆固醇
将0.25g胆固醇溶于50ml的100％乙醇中不要高压
在室温下存放
1 M MgSO 4
将6g硫酸镁四水合物溶解在50ml dH 2 O中，// 高压灭菌器
在室温下存放
1 M CaCl 2
将5.55g CaCl 2二水合物溶解在50ml dH 2 O中，高压灭菌器
在室温下存放
磷酸盐缓冲液
将10.7g K 2 N 2 HPO 4和32.5g KH 2 PO 4溶解至300ml dH 3 2 O
调节pH至6.0
高压灭菌器
在室温下存放
1 N NaOH
将2g NaOH溶解在50ml的dH 2 O中
25 mM左旋咪唑
将0.3g左旋咪唑溶解在50ml的dH 2 O中

致谢

这项工作得到了CONICET（国际考察委员会）和FONCyT（Fondo para laInvestigaciónCientíficayTecnológica）的支持，在拉丁美洲生物科学计划（Philadelphia，PA，USA），富布莱特委员会（华盛顿特区，美国）和前基辅安那府（阿根廷布宜诺斯艾利斯）。我们修改了Stiernagle T的媒体和NGM版的准备工作。线虫。 WormBook。 2006 11：1-11。我们修改了C。来自Montserrat Porta-de-la-Riva的线虫同步等。（2012年）。基本的秀丽隐杆线虫方法：同步和观察。可视化实验杂志; 64，e4019,1-9。

参考

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Duveau，F。和Felix，MA（2012）。多效性在秀丽隐杆线虫中的隐秘发育变化的演变中的作用。 10（1）：e1001230。
Garsin，DA，Villanueva，JM，Begun，J.，Kim，DH，Sifri，CD，Calderwood，SB，Ruvkun，G。和Ausubel，FM（2003）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12817143"target ="_ blank">长寿命C. elegans daf-2突变体对细菌病原体具有抗性。 300（5627）：1921。
Porta-de-la-Riva，M.，Fontrodona，L.，Villanueva，A.和Cerón，J.（2012）。基本 Caenorhabditis elegans 方法：同步和观察 J Vis Exp 64：e4019 。
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Stiernagle，T。（2006）。维护℃。电影。 WormBook 11：1-11。

Wollenberg，AC，Visvikis，O.，Alves，AF和Irazoqui，JE（2013）。金黄色葡萄球菌杀伤细线虫的杀伤试验。生物方案3（19）：e916 。