材料和试剂

Cas9蛋白纯化
1. 1.5 ml Eppendorf管
2. 无菌50ml锥形管
3. 10ml注射器
4. 0.45μm注射器过滤器
5. 蛋白质浓缩器-100K MWCO（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88533）}
6. Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：7311550）
7. BL21-Pro细胞
8. 含有6xHis-SpCas9（Addgene）的pET28质粒
9. 卡那霉素
10. 溶菌酶
11. PMSF
12. Ni-NTA琼脂糖珠（QIAGEN，目录号：30210）
13. Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000205）
14. 牛血清白蛋白（BSA）
15. 氯化钠（NaCl）
16. 胰蛋白胨
17. 酵母提取物
18. IPTG
19. 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）
20. 咪唑
21. 氢氧化钠（NaOH）
22. HEPES
23. 乙二胺四乙酸（EDTA）
24. DL-二硫苏糖醇（DTT）
25. 蔗糖
26. 甘油
27. LB培养基（参见食谱）
28. 1 M IPTG库存（见配方）
29. 裂解缓冲液（见配方）
30. 洗涤缓冲液（见配方）
31. 洗脱缓冲液（见配方）
32. Cas9存储缓冲区（见配方）
体外转录和文库PCR
1. 1.5 ml Eppendorf管
2. 正向和反向寡核苷酸（参见表1和2）
  
  表1.预索引引物
3. dNTP mix
4. Phusion DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：F530L）}
5. PCR纯化试剂盒
6. ATP，CTP，GTP，UTP，100mM MgCl 2，DEPC处理水
7. T7 RNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0251L）
8. DNase I（不含RNase）（New England Biolabs，目录号：M0303L）
9. RNase抑制剂鼠（New England Biolabs，目录号：M0314L）
10. RNeasy MinElute清理套件（QIAGEN，目录号：74204）
11. Illumina Miseq试剂盒（v2）＆nbsp;
12. 转染
  1. 1.5 ml Eppendorf管
  2. 无菌15毫升和50ml圆锥管
  3. 纯化的Cas9蛋白和sgRNA
  4. 衣原体衣原体CC-4349 cw15 mt-（衣藻资源中心）
  5. PCR DNA纯化试剂盒（MG Med，目录号：MD008）
  6. TAP培养基（Harris，1989或Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：A1379801）}
  7. TAP蔗糖溶液（见食谱）
  8. TAP琼脂平板（参见食谱）
  9. 顶级琼脂（见食谱）