材料和试剂

硝酸纤维素0.45μm滤纸（Sartorius，目录号：11306-47-N）
1.2微米玻璃微纤维过滤器（GE Healthcare，目录号：1822-070）
10 ml塑料注射器，Luer滑BD Plastipak（BD，目录号：302188）
25 G针（BD，目录号：300600）
1 ml塑料注射器，Luer打印BD Plastipak（BD，目录号：303172）
1.5 ml微量离心管
Amicon离心浓缩管4ml MWCO 10kDa（Merck，目录号：UFC801096）
由Dulbecco A片剂（137mM NaCl，3mM KCl，8mM Na 2 HPO 4，1.5mM KH 2）组成的磷酸盐缓冲盐水（PBS） / sub> PO 4，pH 7.3）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：BR0014G）
用于缓冲液制剂的超纯水（>18MΩcm）
螺栓 Bis-Tris 4-12％预制凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：NW04120BOX）
BlUeye预染色蛋白标记（Geneflow，目录号：S6-0024）
快速考马斯染色（Generon，目录号：GEN-QC-STAIN-3L）
乙醇绝对（200证明）
硝酸（HNO 3），70％

设备

可重复使用的瓶顶过滤装置（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：DS0320-5045）
真空泵如KNF Neuberger Vaccum Pump（KNF Neuberger，目录号：049268/018121）
500毫升透明杜兰瓶（杜兰，目录号：GL 45）
液相色谱系统，2ml注射回路和馏分收集器;我们使用ÄKTA纯25 L与F9-R级分收集器（GE Healthcare，型号：ÄKTA纯25 L）
尺寸排阻色谱柱;我们使用Superdex 200增加10/300 GL柱，床体积24毫升（GE Healthcare，目录号：28990944）
具有14,000 x g（例如Eppendorf型号：5418 R）的台式冷冻微型离心机
带有紫外线分光光度计的远紫外分光光度计1.8 nm和石英比色皿。我们使用单光束Beckman DU 800仪器与微电池，允许测量体积为50至100μl（Beckman Coulter，型号：DU 800）
具有温度控制的电池座的远紫外圆形二色性（CD）光谱仪。我们使用一个单细胞珀耳帖控制电池座的AVIV 215型仪器（Aviv Biomedical，型号：Aviv Model 215），或者使用B23同步辐射CD（Diamond Light Source，Diamond Light Source）型号的模块B终端分光光度计B23）金刚石光源的光束（Jávorfi等人，2010; Cole等人，2016）。替代工具可从Applied Photophysics Ltd（Leatherhead，U.K.），JASCO Inc.（Easton，MD）和Olis Inc.（Bogart，GA）获得
具有适合路径长度的无菌密封石英比色皿，可安装CD仪器的电池座。我们使用特氟隆阻塞的各种厚度的Hellma Suprasil细胞，大多是0.1厘米的
应使用通风良好的化学通风柜进行清洗，使用HNO 3

软件

需要一个可以导入CD数据文件并允许曲线拟合到用户定义的方程组的分析软件。我们使用Origin版本7.5及更高版本（OriginLab Corp.，Northampton，MA），但还有许多其他程序。例如，Igor Pro，MATLAB，Micromath Scientist，SigmaPlot，等。将工作

程序

pMHC蛋白的纯化和缓冲液交换
如所述产生HLA-A2和人β2-微球蛋白（β2m）序列并克隆到单独的pGMT7表达质粒中（Cole等人，2007）。 HLA-A2，β2m和肽的复合物如（Bulek等人，2012，MacLachlan等人，2017）所述重新折叠和纯化，其基本步骤如下。对于CD分析，蛋白质应该具有高纯度，并且制剂应该缺乏变性或错误折叠的蛋白质的存在。为了达到此目的，蛋白质在分析前一天或分析前一天进行纯化，并储存在冰上以避免任何冻融循环。
1. 使用1ml / 100ml超纯水制备500ml PBS溶液。使用瓶顶过滤装置和真空泵，通过硝酸纤维素0.45μm滤纸将该溶液过滤，将1.2μm玻璃微纤维过滤器作为预过滤器，倒入500ml Duran瓶中。准备另外500毫升杜兰瓶超纯水。
2. 将凝胶过滤柱连接到ÄKTAFPLC系统，用无菌超纯水洗涤，然后用PBS平衡系统。用超纯水清洗2ml注射回路，并使用10ml注射器与PBS平衡，特别注意避免发生可转移到柱中的任何气隙。
3. 使用25 G针将不超过1毫升的蛋白质溶液使用1毫升注射器将注射液转移到注射回路中，以避免任何气泡。
4. 以0.5ml / min运行柱，并通过280nm处的UV吸光度监测洗脱（注1）。收集1ml级分（分数取决于洗脱曲线，但是我们尝试从峰的中心取2-4个级分），并通过SDS-PAGE在还原条件下分析以检查pMHC样品的纯度。我们使用4-12％梯度Bolt Bis-Tris凝胶，BLUeye预染蛋白梯，NuPAGE MES运行缓冲液和Quick Coomassie Stain。
5. 运行SDS-PAGE。在SDS-PAGE上，pMHC解离成其组成部分。 HLA-A2和β2m的带分别在对应于〜32和〜12kDa的位置运行。肽（〜1 kDa）将从凝胶中流出（图1）
6. 仅使用最纯净的两个或三个级分组合并使用具有10kDa的MWCO的Amicon离心过滤管进行浓缩。这为CD分析提供了足够的纯度和浓度的蛋白质
7. 在CD测量之前，通常在4℃下将样品以14,000 x g旋转20分钟，通常不会产生任何可见的颗粒物。
  
  图1. pMHCI的SDS-PAGE分析将约20μg的pMHCI（右泳道）加载到4-12％梯度Bolt的Bis-Tris凝胶上，其中3 μlBLUeye预染蛋白梯（左泳道），并在NuPAGE MES运行缓冲液中在200V下运行23分钟。将凝胶在Quick Coomassie Stain中染色5分钟，并用ddH 2 O进行脱色。 pMHCIα链在〜32 kDa和β2m处以〜12 kDa的单独条带运行。
参数的确定
1. 在1厘米石英比色皿中记录上清液（步骤A7）的紫外光谱从360至230nm，减去缓冲液基线。在360至320 nm范围内，吸光度应基本为零;任何斜率都是由于光散射，表明存在大的聚集体
2. 使用ProtParam网站 http://web.expasy.org/protparam/ 。
  由于HLA-A2和β2-微球蛋白序列组合中的芳香残基Tyr（5.3％）和Trp（3.2％）含量高（参见补充1和2 ），对于（吸收系数）。由于HLA-A2和β2-微球蛋白分别具有两个和一个链内二硫键，因此包括胱氨酸对吸收的贡献（ProtParam选项：“假设所有成对的Cys残基形成胱氨酸”）。

数据采集

基于如上所述确定的储备溶液的浓度，用缓冲液稀释等分试样以导致ca。 600μlc〜0.15 mg / ml（〜3μM）的样品，并记录进一步的吸收光谱，得到最终的蛋白质浓度（注2）。
按照CD仪器的常规启动程序（30分钟用N 2冲洗，接着再进行30分钟时间以稳定氙弧灯），记录缓冲液的光谱（步骤A1）在260至195nm的干净的0.1-cm塞电石英池中，电池座平衡至4℃。该谱称为基线。我们通常使用1 nm带宽以0.2 nm的间隔记录光谱，每个数据点的测量时间为3或4秒，导致ca 。每光谱20至25分钟（注3）
在动态模式下，以恒定波长的218 nm，以2秒的间隔记录1分钟的进一步缓冲基线
用水冲洗清洁细胞，然后用无水乙醇冲洗，并在氮气流下干燥
用蛋白质溶液（〜550μl）完全填充相同的细胞，用Teflon塞子紧密封闭，避免捕获气泡，并以与记录基线相同的方向放入CD细胞座。
在〜2分钟后允许温度平衡，使用与基线相同的仪器设置记录蛋白质谱。如果光电倍增管的电压为< 500 V（注4）。
对于温度变性，将波长设置为218 nm（CD光谱最小）。使用以下参数在0.5°C间隔内记录椭圆度的变化，从4到〜80°C：数据采集12秒/点;温度平衡12秒;温度死区0.3°C;仪器加热速率为4°C / min。在数据采集间隔期间，样品通过闭合的狭缝与光束屏蔽。这些设置导致平均加热速度为〜36°C / h（注5）
在升高的温度下，HLA-A2 /β2m/肽复合物形成大的可见聚集体（沉淀），导致熔化曲线的急剧变化，并且增加了表示增加的散射的倍增极电压。此时可以停止测量。
清洁含有比色皿的蛋白质沉淀物，用水彻底冲洗，然后在通风橱中填充70％HNO 3，孵育2小时至过夜，用水，乙醇冲洗，并用N sub> 2 。

数据分析

将CD数据文件导入到OriginLab软件中（注6）。

对于光谱分析，减去缓冲液基线。将经典单位（deg cm 2 dmol）中记录的mdeg至摩尔椭圆度Θ[Θ] 归一化Θ -1 ）根据：

浓度（mg / ml），细胞路径长度（mm）（mm）（注7）。

在动力学模式（步骤C3）中从热熔体椭圆度减去在218nm处记录的Θ的平均值，并归一化为[Θ] > 218nm 根据等式（3）

热稳定性的分析假设其中三个未折叠的多肽链U结合到天然复合物N的2-状态机制：

其中，平衡常数K为：

具有总链集合sub> +3 CN ，并且转换为本机状态的程度 = 3 > 0 （参见 eg ，Engel等人，1977; Marky和Breslauer，1987）。标准吉布斯自由能可写为：

（3）ΔG 0 = -RT ln K =ΔH 0 - TΔS 0 （6）
其中R是气体常数（8.3145 JK -1 mol -1 ），ΔH标准焓和标准熵的标准焓值，和/或标准熵。从等式（5）和（6）之后，对于转变的中点，其中，f'= 0.5和等于解链温度T m > ，其中一半的蛋白质分别处于折叠和展开状态，即

这意味着与单链多肽相反，熔融温度是浓度依赖性的。和通过将整个过渡曲线拟合为van't Hoff方程：

通过求解方程（7）对于ΔS 而代之以/ sup> （6）。
用于原始和解折叠状态[Θ] 和[Θ] 的摩尔椭圆度表示另外的温度依赖性，其在第一近似中可以假定为线性： />
[Θ] n = [Θ] n 0 + b T和[Θ] = [Θ] u 0 + b u T（9）

其中，[Θ] n 0 和[Θ] 0 对应于T处的[Θ]截距= 0，并且b sub分别描述天然和未折叠状态的斜率。整个过渡曲线由以下描述：

[Θ] = F（[Θ] n 0 + b T - [Θ] T（10）

T（10）

它用于与OriginLab中实现的Levenberg-Marquardt算法拟合。拟合脚本的基本部分包括为补充4 。

由于HLA-A2 /β2m/肽复合物倾向于在过渡区域内沉淀（步骤C8），所以我们假设共同的摩尔椭圆率[Θ] 对于许多温度变性蛋白质和模型肽[Θ] = 0，观察到在-4,000至-5,000 deg cm 2 dmol -1 范围内的值（Venyaminov et al。 / em>。，1993）（注8和9）

代表数据
使用HLA-A2 /β2m/ ILAKFLHWL作为实例说明分析三聚体pMHC复合物的稳定性的一般程序（图2）。该复合物已经被详细分析（Cole等人， 2017），结构已经与TCR（蛋白质数据库条目5MEN）复杂化。

图2. HLA A2 /β2m/ ILKA的热稳定性。 A.蛋白浓度通过紫外吸收光谱法测定。使用与随后的CD测量中使用的相同的样品和缓冲液，将记录在1cm的石英比色杯中的从360nm到230nm的波长扫描。基于氨基酸组成计算出的吸光度系数 = 2.257计算浓度。 B.在4℃下在0.1cm石英比色杯中记录远紫外光谱，减去使用相同仪器参数在相同电池中测量的缓冲液基线。信号被归一化为平均残差权重（MRW）椭圆率[Θ] MRW 式。（3）。 C.通过以ΔT= 0.5℃的间隔以每个数据点测量12秒，在数据点之间的平衡时间为12秒，温度死区为±0.3，在增加温度时，以218nm的椭圆率Θ测定热稳定性°C，并且在测量之间使用狭缝封闭，导致36℃/ h的平均加热速率（红色，左轴）。样品形成大的可见聚集体，表明在58至65℃范围内的沉淀（空心圆圈）。低于该温度（实心圆）的数据点符合式。（10）导致虚线。聚集形成伴随增加的光散射，导致倍增电压（蓝色，右轴）急剧增加，随后大颗粒沉入比色皿底部时减少。

通过将所有三个序列（补充1到3 ）进入ProtParam的输入框（步骤B2），导致：

氨基酸数量：386
>分子量：44820.03
.....
消光系数以M为单位 - 1 cm - 1 style =“font-family：Courier New;”>，以280nm测量水中。
Ext。系数＆NBSP;＆NBSP; 101675
Abs 0.1％（= 1 g / L）＆nbsp;＆nbsp;假设所有成对的Cys残基都形成胱氨酸＆nbsp;

测量的蛋白质溶液的吸收（图2A）显示了等式1的 = 0.283。（1）浓度为0.283 / 2.269 = 0.125mg / ml

MRW根据公式（2）为MRW =（44,820.03 + 2×18.02）/（386-3）= 117.12。

根据步骤C2至C6使用0.1cm路径长度的比色皿记录两个溶液的CD缓冲液基线和光谱。减去基线，根据方程式对光谱进行归一化。（3）（图2B）。在195nm处，倍增极电压为〜500V。这反映了PBS中包含的氯离子的高吸光度。光谱在218nm处显示出最小的 [Θ] = -8,950 deg cm 2 dmol -1 。

如步骤C7中所述从4℃至65℃记录熔解曲线，减去基线的平均值（步骤C3），并根据方程式计算摩尔残差椭圆度。（3）（图2C）。使用“补充4 < / a>根据公式拟合数据（10）。从拟合中省略了显示与表示蛋白质聚集的均匀准S形曲线（图2C中的露点）显着偏差的59至65℃范围内的值。拟合结果 = 54.5±0.1°C和 = -500±20kJ / mol，测定系数r = 0.988。

笔记

pMHC的峰分离将以约12ml的洗脱体积进行;重要的是保持最纯净的部分，并丢弃任何含有超过一个峰值的蛋白质。
为了确定热力学参数，对于HLA-A2 /β2m/肽复合物，我们的目的是浓度为〜0.15mg / ml，因为迄今为止研究的大多数肽可以相对容易地实现，并提供良好的信噪比遵循218 nm的CD转换曲线。由于多链蛋白质的浓度依赖性[等式[ （7）]，重要的是定义一个狭窄的范围以允许数据比较。
如果使用PBS或水的基线平行于光束中记录的光谱（“空气基线”），则可以将比色杯视为光学清洁。在200至225nm范围内观测到的最小值通常表示来自先前测量的蛋白质被吸收到石英表面
在其他制造商的仪器上，倍增电压称为HT（高压），可靠的电压范围可能因光电倍增器和电子设备的类型而不同。
已经测试了加热参数，通过在0.1厘米比色杯内使用Pt100电阻温度检测器进行测量，得出设定的平衡温度。
AVIV仪器软件以ASCII格式存储数据。其他制造商的一些仪器使用必要的格式，需要通过其他程序导出为ASCII进行分析
可以将MRW 转换成摩尔吸收单位Δε=ε L / sub> = [Θ] MRW / 3,298，其中Δε是左旋和右旋圆偏振光的吸收差。
从我们实验室研究的各种MHC复合物中，HLA-A * 0101 /β2m/肽VTEHDTLLY在相对于Tm（68.9℃）和焓（-719kJ mol / -1 ）;降水仅在T> 72℃，[Θ] 0 （Jones等人，2016）。使用[Θ] U 2>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ＆gt; 0.996。
对于严格的热力学分析，转变的可逆性[等式（4）]是主要要求。然而，有人建议，即使可逆性有限，分析仍然是有价值的，因为温度诱导的协同展开通常比未折叠蛋白质的聚集快得多（Privalov，2009）。为了允许比较数据，我们对所有样品使用相同的加热参数（参见步骤C7）。

致谢

DKC是威康信托研究职业发展研究员（WT095767）。 AKS是Wellcome Trust高级研究员。英国生物技术与生物科学研究理事会（BBSRC）（Grant BB / H001085 / 1）支持了使用所述程序的原始作品。购买CD文件部分由BBSRC 75 / REI18433资助。

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