材料和试剂

移液器提示
6孔板，组织培养处理（Corning，Costar ®，目录号：3506）
15 ml Falcon ®锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352196）
0.45μm注射器过滤器（VWR，目录号：514-8021）
24孔板，组织培养处理（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：CC7682-7524）
96孔板，组织培养处理（Corning，目录号：3598）
观察板-96黑色，光学透明底部，组织培养处理，无菌，96孔带盖（PerkinElmer，目录号：6005182）
10厘米平板，组织培养处理（康宁，目录号：430167）
293T细胞系（ATCC，目录号：CRL-3216）
KBM7细胞系（慢性骨髓性白血病）（Horizon Discovery，目录号：C628）
荧光报道载体（LZRS-RFP-ires-ZEO逆转录病毒载体，来自S.Nijman Lab，Ludwig Cancer Research，Oxford）的一份礼物
包装载体（例如，pCMV-Gag-Pol逆转录病毒载体，Addgene，目录号：14887; pCMV-VSV-G包膜载体，Addgene，目录号：8454）
DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41965039）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10500064）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
Opti-MEM
IMDM介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：21980032）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190094）
S ） - JQ1（MedChemExpress，目录号：HY-13030）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

设备

移液器（Gilson）
细胞培养离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-18K，目录号：10290）
FACS（BD，BD Bioscience，型号：BD FACSCALIBUR）
FACS分选机（BD，BD Biosciences，型号：BD FACSAria）
荧光显微镜（PerkinElmer，型号：HH12000000）
细胞培养罩（Thermo Fisher Scientific，型号：Herasafe TM，目录号：51022515）
细胞培养培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy 170R，目录号：CO170R-230-1000）

程序

病毒准备
1. 将293T细胞以20万个细胞/ ml接种，并在6孔板中在DMEM加10％FBS中生长至60％汇合。当它们达到这样的汇合率（通常是在一天之后）时，根据制造商的说明书，它们使用Lipofectamine 2000转染，以产生报告生成所需的病毒（见下文）。为了获得最佳的病毒生产，重要的是使用低通道数的293T细胞，并且从未过度融合。
2. 对于LZRS-RFP-ires-ZEO逆转录病毒生产，将1.5μgLZRS-RFP-ires-ZEO逆转录病毒载体与1.5μg包装载体（pCMV-Gag-Pol逆转录病毒载体8：1 pCMV-VSV-G包络矢量）。简单地（1孔），将载体稀释并轻轻混合在250μlOpti-MEM中。将5μl的Lipofectamine 2000稀释在250μl的Opti-MEM中，并在RT（室温）下孵育5分钟。孵育5分钟后，将载体稀释液和Lipofectamine 2000稀释液合并并轻轻混合。将该悬浮液在室温下孵育20分钟，然后逐滴加入细胞培养基中。最后，通过前后摆动轻轻地混合板，以均匀分布转染溶液。
3. 在转染后30和48小时通过收集培养基进行病毒收获，在室温下将其在1500ml Falcon圆锥形离心管中离心15分钟，然后通过0.45μm注射器过滤器过滤新的15 ml Falcon锥形离心管（RT）。
  注意：此时病毒可用于滴定和细胞感染（步骤2和3）或存储于-80°C。
病毒滴定
1. 将KBM7细胞以2×10 6细胞/ ml（1ml /孔）的IMDM加10％FBS的6孔板接种，然后使用不同比例的培养基/病毒进行感染。将病毒重新悬浮于1ml IMDM加10％FBS中。以这种方式，最终细胞浓度为10μg/ ml细胞/ ml
2. 通常测试的比例是：1/100，1/40，1/20，1/10，1/4和1/2（病毒体积对细胞体积）。
3. 一旦加入病毒（Polybrene储备溶液为5 mg / ml），将细胞培养基中的每个孔加入5μg/ ml（终浓度）的聚凝胺。
4. 感染后24和48小时，细胞在PBS中洗涤，培养基用新鲜等分试样（2ml /孔）置换。每孔的细胞在5ml PBS（RT）中重新悬浮一次，然后在室温下以1,200×g离心5分钟。
感染后48小时，进行FACS分析，以检查每个井/感染率的百分比。选择使细胞感染的25％至40％的病毒浓度（25-40％的RFP阳性细胞）用于记者生成（因此确保每个细胞可能不会发生多于一次的感染事件）。 LZRS-RFP-ires-ZEO感染。
1. 将KBM7细胞接种在10-μl细胞/ ml（总共30×10 6个细胞）的IMDM加10％FBS的6孔板中。
2. 将KBM7细胞用0.5μM（J）JQ1处理18小时，然后用LZRS-RFP-ires-ZEO逆转录病毒感染（使用在步骤2中测定的病毒浓度）。
3. 感染后24和48 h培养基发生变化; （ S ） - JQ1以0.5μM保存在培养基中
首先排序（池）
RFP阳性细胞在0.5μM（SEQ ID NO：）JQ1存在下分选（整个群体分类：细胞数目在此阶段约120×10 -6）。
二次排序（单细胞）
（） - JQ1从培养基中除去，30小时后将RFP阴性人群分选成单细胞克隆。填充约10个96孔板;其余细胞在IMDM培养基中加10％FBS和10％DMSO冷冻注意：通常对于分选过程，细胞必须在5ml PBS（RT）中洗涤至少一次，在室温下以1,200×g离心5分钟，并重悬于0.5ml PBS中（允许的最大细胞浓度为30x 10
细胞/ ml）;我们建议将10％的细胞培养基加入重悬，以避免细胞簇形成，特别是在首次分选过程中。
单克隆扩增和记录选择
1. 在IMDM培养基加10％FBS和10％DMSO的10×10 6个细胞的等分试样中扩增出大量的克隆（步骤5后约10天）。将每个克隆的20,000个细胞接种在96孔板（Viewplate-96黑色，光学透明的底部）中，并用（J） - JQ1处理24小时。
2. 使用Operetta高内容成像系统（20x物镜和非共焦模式）对图像进行成像（图1）。如果之后（） - JQ1治疗能够表达RFP，则选择克隆作为报告者。
  
  图1
3. S - JQ1治疗激活KBM7报告细胞中的RFP表达。活细胞成像用0.5μM（）JQ1处理24小时的KBM7报道细胞的图片;加入等量的DMSO作为对照（比例尺=100μm）