材料和试剂

3.5厘米细胞培养皿（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：627160）
无菌吸管过滤嘴200和1,000μl（Greiner Bio One International，目录号分别为739288和740288）
Parafilm M（Sigma-Aldrich，目录号：P7668）
15ml离心管（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：188261）
50ml离心管（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：227261）
1.8毫升圆底低温管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：375418）
0.22μm注射器过滤器（GVS，目录号：1213641）
10和20毫升注射器（分别为SFM医院产品，目录号：534235和534236）
2和10ml血清移液管（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：710180和607107）
磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4片（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：18912014）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：76240）
注意：本产品已停产。
氢氧化钠（NaOH），10M（Sigma-Aldrich，目录号：72068）
纤连蛋白人类（Imtek，目录号：H Fne-C）
Vitronectin人类（Imtek，目录号：H Vne-C）
胶原蛋白IV牛（Imtek，目录号：B C44-C）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
乙醇96％（Sigma-Aldrich，目录号：24105）
注意：本产品已停产。
无菌蒸馏水
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（参见食谱）
甲醛溶液（见配方）
人纤连蛋白溶液（新鲜制备）（参见食谱）
人玻连蛋白溶液（新鲜制备）（参见食谱）
牛胶原IV溶液（新鲜制备）（参见食谱）

设备

移液器控制器（Corning，目录号：4091）
自动单通道移液器，20-200和100-1,000μl（Gilson兼容）
磁性热板搅拌器（Sigma-Aldrich，目录号：Z168580）
7×2mm的电磁搅拌棒（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：14-513-63）
层流组织培养罩
注意：该项目可以从任何合格的公司订购。
带内置电源插座的冰箱
注意：该项目可以从任何合格的公司订购。
CO 3培养箱（Sanyo，目录号：MCO-18AIC）
注意：本产品已停产。可能的替代品：Panasonic Healthcare，型号：MCO-18AC。
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
高压灭菌器
注意：该项目可以从任何合格的公司订购。

程序

涂布纤维连接素培养皿，然后甲醛固定注意：以下所有步骤均应在层流罩下进行。
1. 加入1 ml的50μg/ ml纤连蛋白溶液（参见食谱）到每个3.5厘米培养皿中。确保整个菜表面完全覆盖，轻轻地旋转溶液或使用移液器吸头将其重新分布在表面上。
  注意：纤连蛋白层对于指定体积只有约1毫米深，因此建议用放置在严格水平表面上的培养皿进行此操作，以确保均匀覆盖该盘的所有区域。 >
2. 在加湿的CO 2培养箱中，将盖子与37℃孵育1.5小时。
3. 小心吸出并保存纤连蛋白溶液。
  注意：保存的纤连蛋白溶液可以重复使用至少一次。将其储存在4°C，并在一周内使用。
4. 加入1 ml的0.4％甲醛溶液（参见食谱）。在无菌层流罩下用盖子孵育20分钟
5. 小心吸出甲醛溶液，用2 ml无菌PBS洗涤两次，然后用4 ml无菌PBS洗涤4次。
  注意：甲醛溶液应作为危险废物处理。
6. 在层流罩下干燥1小时。
  注意：纤连蛋白覆盖的菜肴可以用Parafilm密封，并在使用前在4℃下储存长达1周。
涂覆维生素后培养皿，然后甲醛固定注意：以下所有步骤均应在层流罩下进行。
1. 向每个3.5厘米培养皿中加入0.5毫升10微克/毫升的玻连蛋白溶液（参见食谱）。确保整个菜表面完全覆盖，轻轻地旋转溶液或使用移液器吸头将其重新分布在表面上。
  注意：针对所指定的体积，玻连蛋白层的深度仅为0.5毫米深，因此建议使用放置在严格水平表面的培养皿进行此操作，以确保均匀覆盖该盘的所有区域。 / >
2. 在加湿的CO 2培养箱中，将盖子与37℃孵育1.5小时。
3. 仔细吸出并保存玻连蛋白溶液。
  注意：保存的玻连蛋白溶液可以至少重新使用一次。将其储存在4°C，并在一周内使用。
4. 加入1 ml的0.4％甲醛溶液（参见食谱）。在无菌层流罩下用盖子孵育20分钟
5. 小心吸出甲醛溶液，用2 ml无菌PBS洗涤两次，然后用4 ml无菌PBS洗涤4次。
  注意：甲醛溶液应作为危险废物处理。
6. 在层流罩下干燥1小时。
  注意：使用玻璃纤维素覆盖的菜肴可以用Parafilm密封，并在使用前在4℃下储存长达一周。
用胶原蛋白IV培养培养皿，然后用甲醛固定注意：在冰箱中进行涂层培养皿过夜，其余步骤应在层流罩下进行，同时将胶原蛋白溶液保持在冰上，并尽量减少暴露于室温条件。
1. 向每个3.5厘米培养皿中加入0.5毫升50微克/毫升胶原蛋白IV溶液（见食谱）。确保整个菜表面完全覆盖，轻轻地旋转溶液或使用移液器吸头将其重新分布在表面上。立即将菜肴转移到冰箱。
2. 在4℃下将盖子与盖子一起孵育。
  注意：指定体积的胶原蛋白层的深度仅为0.5毫米深，因此使用放置在严格水平表面上的培养皿进行此操作非常重要，以确保均匀覆盖该盘的所有区域。 >
3. 将盘子转移到层流罩上，小心吸出并保存胶原蛋白溶液注意：保存的胶原蛋白溶液可以至少重新使用一次。将其储存在4°C，并在一周内使用。
4. 加入1 ml的0.4％甲醛溶液（参见食谱）。在无菌层流罩下孵育20分钟。
5. 小心吸出甲醛溶液，用2 ml无菌PBS洗涤两次，然后用4 ml无菌PBS洗涤4次。
  注意：甲醛溶液应作为危险废物处理。
6. 在层流罩下干燥1小时。
  注意：纤维连接蛋白覆盖的菜肴可以用Parafilm密封，并在使用前在4℃下储存长达一周。

数据分析

ECM蛋白涂层和固定成功的评估包括MSC或其他原代细胞增殖率的分析。通过每3.5cm培养皿接种15-30万个细胞，然后培养1或2天来确定增殖速率。最小的测试设置包括：a）控制未经处理的菜肴; b）涂有ECM蛋白但不固定的餐具; c）涂有ECM并用甲醛固定的盘子。每个变体一式三份进行，培养后的细胞通过胰蛋白酶消化收集，随后手动或自动细胞计数。建议使用独立细胞等分试样对每个细胞样品进行两次或三次的计数，以提高分析的准确性。当细胞处于指数生长期，即细胞汇合不超过50％时，评估细胞增殖是重要的。增殖率可以表示为扩增因子（收获到种子细胞的比例）或群体倍增（扩增因子的log 2）。通过确定平均值，标准偏差和执行Student's 测试来分析结果。这种分析的典型结果如图1所示

图1.受控的纤连蛋白固定显着增强间充质干细胞（MSC）的扩增。在对照未涂覆的培养皿（TCP）和50μg/ ml浓度的纤连蛋白包被的培养皿上，在缺氧条件（5％O 2 2）下的小鼠MSC生长。将纤连蛋白包被的培养皿未固定（FN / 0％）或用0.2％甲醛（FN / 0.2％）或0.4％甲醛（FN / 0.4％）固定。 Y轴描绘在24小时内由文化进行的群体倍增数。数据以平均值±SD表示。

笔记

Imtek是一家俄罗斯公司，其中生产用于细胞培养的细胞外基质蛋白。他们的网站： http://new.imtek.ru/eng 。我们还没有其他公司的细胞外基质蛋白的经验。
我们设置20分钟固色时间的甲醛浓度最高，为0.3％-0.4％。较高的甲醛浓度导致对细胞增殖的影响减弱（Andreeva等人，2016）。当与未经我们测试的其他细胞外基质蛋白一起使用时，建议使用甲醛浓度范围为0.2％至0.6％的测试固定剂，以找到最佳的固定条件。
我们设置的甲醛固定（即层流罩下）的测量温度为24°C至26°C。由于固定水平取决于温度，因此建议确定层流罩下的温度，以确保与上述温度的偏差不超过2°C。如果温度超出此范围，建议在稍微不同的时间段内执行测试固定，以确定给定实验装置的最佳固定时间。
根据我们的结果（Andreeva等人，2016），与50μg/ ml浓度的纤维连接蛋白涂布培养皿与10μg/ ml浓度相比产生更好的结果，而增加纤连蛋白浓度250μg/ ml只产生一个小的附加效应。虽然我们还没有测试，但是在我们的方案中使用的1.5小时时间内延长涂布时间是非常有可能产生10μg/ ml浓度的纤连蛋白层效应的显着增加。
与纤连蛋白和胶原IV（50μg/ ml）相比，以较低的浓度（10μg/ ml）进行玻连蛋白的涂覆，由于该蛋白质的高成本，并且产生比后两种蛋白质观察到的效果更小的效果（Andreeva等人，，2016）。基于与纤连蛋白结果的类比，塑料涂层中玻连蛋白浓度的增加可能会产生更大的影响。
由于用于不同类型血管和各种制造商的塑料表面的处理可能不同，固定的细胞外基质蛋白质层对细胞增殖的影响是可能变化的。在我们手中，纤连蛋白涂层，然后固定，对于3.5厘米培养皿比6孔板更有效。
储存期间甲醛可在较低温度下聚合，并在较高温度下分解，从而降低有效甲醛浓度。因此，建议在一周内使用所制备的甲醛溶液，最好每次固定实验新鲜制备甲醛溶液。
重要的是，在低温下处理胶原蛋白IV以防止其甚至在室温下发生的慢变性。
在我们测试的细胞类型中，观察到间充质干细胞（鼠类和人类）中最显着的作用，对于成纤维细胞获得较小的效果，并且对已建立的细胞系没有观察到阳性效应（Andreeva等人，2016）

食谱

1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4 2片PBS（10克）
加入蒸馏水至最终体积为1升高压消毒灭菌
在室温下存放
甲醛溶液
用磁力搅拌棒将4.0g多聚甲醛加入到烧杯中加入蒸馏水至最终体积100 ml 煮沸直到完全溶解在热板磁力搅拌器上，冷却下来
将10 N NaON滴加至pH 7.4 储存于5°C，1周内使用
在无菌1x PBS下将实验前稀释至所需浓度（通常为0.4％）
人纤连蛋白溶液（新鲜准备）
1 ml纤连蛋白无菌溶液1 mg / ml
19 ml无菌1x PBS
储存于4°C，一周内使用
人玻连蛋白溶液（新鲜准备）
0.25毫克无菌玻连蛋白干粉
25 ml无菌1x PBS
储存于4°C，一周内使用
牛胶原IV溶液（新鲜准备）
注意：
1. 所有操作应在0℃至5℃的温度下使用预冷的溶液进行。
2. 在70％乙醇中使用磁铁1小时之前，然后在紫外线照射下1小时，将磁铁灭火。

将1.0ml 20mM乙酸（过滤灭菌）加入到1.8ml圆底冰箱中的0.5mg无菌胶原IV干粉中，
加入一个小尺寸的磁力搅拌棒，并在4°C的磁力搅拌器下将胶原溶液搅拌过夜
用冷无菌20mM乙酸稀释制备的胶原IV溶液10倍至终浓度为50μg/ ml
将最终溶液储存在4°C的温度下，在一周内使用

致谢

本文描述的方案改编自Andreeva等人。（2016）。这项工作得到俄罗斯基础研究基金会的资助（第14-04-01855号）和2013-2020年度国家学院基础研究计划的支持（任务0103-2014-0006子程序＃58分子遗传学遗传信息的实现机制，生物工程）。

参考

Andreeva，NV，Leonova，OG，Popenko，VI和Belyavsky，AV（2016）。＆nbsp; 用于扩展间充质干细胞的纤连蛋白层的受控甲醛固定。 Anal Bioch 514：38-41。

Prewitz，MC，Seib，FP，von Bonin，M.，Friedrichs，J.，Stissel，A.，Niehage，C.，Muller，K.，Anastassiadis，K.，Waskow，C.，Hoflack，B.，Bornhauser ，M.和Werner，C。（2013）。紧密锚定的组织模拟基质作为指导性的干细胞微环境。 Nat方法 10（8）：788-794。

Rajaraman，G.，White，J.，Tan，KS，Ulrich，D.，Rosamilia，A.，Werkmeister，J.and Gargett，CE（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href = http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22738377“target =”_ blank“>人子宫内膜多能间充质基质细胞的优化和放大培养：临床应用的潜力。组织工程C部分方法 19（1）：80-92。

Sawada，N.，Tomomura，A.，Sattler，CA，Sattler，GL，Kleinman，HK和Pitot，HC（1987）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi .nlm.nih.gov / pubmed / 2883170“target =”_ blank“>细胞外基质组分对培养的大鼠肝细胞的生长和分化的影响。体外细胞发育生物 23（ 4）：267-273。