材料和试剂

4-0手术缝合线
0.2微米注射器过滤器（Sartorius，目录号：17823-K）
0.45μm注射器过滤器（Sartorius，目录号：16555-K）
Falcon管50ml（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
Falcon管15ml（Corning，Falcon ^{®，目录号：352099）}
T75培养瓶（SPL LIFE SCIENCES，目录号：70075）
多聚腺管38ml（Beckman Coulter，目录号：344058，用于梯度形成和分级）
多聚腺管13.2ml（Beckman Coulter，目录号：344059，用于梯度形成和分级）
8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠（Koatech）
来自延世细胞治疗中心或从Lonza购买的脂肪干细胞（Lonza，目录号：PT-5006）的人类脂肪组织来源的MSC（来自2个健康女性供体，第4代）
异氟烷（Hana Pharm，韩国）
80％N 2 O
20％O 2
氯胺酮
赛拉宾
Bradford蛋白测定试剂盒I（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000001）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Biowest，目录号：L0615-500）
胰蛋白酶/ EDTA（0.05％，酚红）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：25300054）}
台盼蓝溶液0.4％（生理盐水）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15250061）}
DMEM低糖（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SH30021.01）}
青霉素/链霉素（5,000U / ml）（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SV30010）}
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SH30071.03）}
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ，目录号：15630080）}
10mM Tris-HCl（WHITLAB，目录号：BTH-9274）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
EDTA（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610729）
OptiPrep ^{TM （Alere Technologies，Axis-Shield Density Gradient Media，目录号：1114542）}
MSC培养基（见食谱）
蔗糖稀释缓冲液（参见食谱）
蔗糖垫（见食谱）
OptiPrep ^{TM 解决方案（请参阅配方）}

设备

手术剪刀 - 直尖/钝12厘米（精细科学工具，目录号：14001-12）
窄幅镊子 - 弯曲12厘米，2 x 1.25毫米（精细科学工具，目录号：11003-12）
虹膜剪刀 - 大环，角度（精细科学工具，目录号：14107-09）
手术刀手术刀（精细科学工具，目录号：10011-00，10003-12）
骨髓（JEUNG DO BIO＆amp; PLANT，目录号：H-2041-1）
成年大鼠脑基质（Kent Scientific，目录号：RBMS-300C）
组织研磨机（WHEATON，目录号：357546）
移液器
10ml血清移液管（SPL LIFE SCIENCES，目录号：91010）
冰桶
离心机（Eppendorf，型号：5804）
具有100kDa膜的Minimate TFF胶囊系统（Pall，目录号：OA100C12）
玻璃巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy 170S）
倒置显微镜（Olympus，型号：CKX41）
血细胞计数器
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^{TM XPN-100）}
转子：SW41Ti（Beckman Coulter，目录号：331362）
转子：SW32Ti（Beckman Coulter，目录号：369650）
蠕动泵（Poong Lim Tech，目录号：PP-150）
Masterflex L / S易于加载II型精密管道头，PPS / CRS（Cole-Parmer，目录号：EW-77200-50）
饲料池（100ml或500ml）

程序

永久性大脑中动脉闭塞和脑提取物制剂的程序
1. 准备两只8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，一只为正常，一只为缺血性脑损伤。
  注意：一只大鼠的大脑足以进行本实验规模的5-10次实验。
2. 缺血性脑损伤（MCAO手术）
3. MCAO手术后24 h，正常大鼠和缺血性脑损伤大鼠腹腔注射氯胺酮（40 mg / kg体重）和赛拉嗪（5 mg / kg体重）深度麻醉，然后用生理盐水灌注。 br />
4. 灌注大鼠后，用手术剪刀从耳朵后面切下头部。快速地在头皮肤中进行中线切口，用骨骼肌无菌除去头骨和脑膜。
  注意：如先前Spijker（2011）所述，进行大鼠牺牲和脑组织提取的方法。
5. 将全脑置于脑基质上后，从同侧半球的冰上进行冠状动脉夹层中部大脑动脉区域（1〜+ 1 mm），收集切片脑组织（图1A）。
6. 使用组织研磨机均匀化组织片。
7. 离心组织匀浆在100,000 xg 2℃，4℃，然后取上清液。
8. 在4℃下将100,000xg上清液离心1小时（图1B）。
9. 通过0.2μm过滤器过滤上清液。使用Bradford测定法测量蛋白质含量（图1C）。（蛋白质的典型总量为120-220毫克）
  
  图1.脑提取物的制备A.将大鼠脑放置在脑基质上，从同侧半球冠状动脉切开大脑中动脉区域（1〜+ 1毫米），收集切片的脑组织。 B.将大脑匀浆物超声离心以除去大鼠脑源性微泡，过滤以除去残留的聚集体和细胞碎片。 C.最后通过0.2微米注射器过滤器过滤上清液，将等分试样储存在-80℃
细胞培养程序
1. 在37℃水浴中快速解冻（小于3分钟）冷冻人MSC（hMSC）小瓶。
2. 将全部冷冻管内容物吸入无菌的50ml锥形管中，小心地加入10体积的预热完全培养基（含10％胎牛血清的DMEM）。
3. 经温和旋转后，用血细胞计数器测定细胞浓度，并用预热的完全培养基调整3×10 5 / ml的细胞浓度。
4. 在约8×10 3细胞/ cm 2的范围内接种75cm 2烧瓶，并在37℃下在5％CO 2中孵育， 2 孵化器。
5. 在解冻后24小时用新鲜预热的完整培养基更换培养基。
6. 在倒置显微镜下常规观察培养瓶。
7. 当细胞几乎汇合（超过80％汇合）时，吸出培养基和来自汇合单层的浮选碎片并丢弃。
8. 用预热的PBS洗涤细胞一次，并向培养瓶中加入5ml的0.05％的Trypin-EDTA。在37°C孵育至50-70％分离（约2-5分钟）
9. 加入5ml预热的完整培养基，轻轻移液上下分离贴壁细胞，将细胞分散到单细胞悬液中。
10. 将细胞悬浮液转移到无菌的50ml锥形管中。用另外的5ml完整培养基洗涤烧瓶并合并成锥形管
11. 以300×g离心细胞悬浮液5-10分钟
12. 吸出上清并将沉淀重新悬浮在适量体积的预热完全培养基中
13. 将总共50个烧瓶（75cm 2）与20ml / 1ml10μg/ ml活细胞接种，用于微泡分离并返回培养箱。
  注意：细胞培养物应每3天用新鲜的完整培养基重新喂养，以获得最佳细胞生长。
14. 当细胞几乎融合（超过80％汇合）时，在室温下用PBS大量洗涤细胞或在37℃预热（5次，每次洗涤10ml）。
15. 最终洗涤后，用含有300μg脑提取物或缺血脑提取物（终浓度为15μg/ ml）的20ml具有血清和抗生素的低葡萄糖DMEM培养基代替培养基。 48 h后收获培养上清液，分离微泡（MV）（图2）
  
  图2. MSC培养。：一种。 hMSCs的显微镜图像; B.细胞培养的规模; C.实验时间表。将原代培养的MSC（2×10 6细胞/烧瓶）接种在75cm 2培养瓶（共50个烧瓶）中。 C.在完全培养基中培养后，用无血清抗生素培养基替换培养基48小时，收获培养上清液以分离微泡。
  注意：由未处理的MSC制备的MV具有低蛋白质产量（<0.3mg / 3×10 7细胞/ 48小时）而来自MSC条件培养基的MV的量通过用正常或缺血性脑提取物（2.2mg / 3×10 8）细胞/来自正常脑提取物处理的MSC的MVs的48小时和来自缺血的MV的2.5mg / 3×10 7细胞/ 48小时脑提取物处理的MSC）。
分离微泡（MV）
1. 收集来自MSC培养物的培养上清液（条件培养基约1,000ml）
2. 为了去除细胞和细胞碎片，将收获培养上清培养基以500×g离心10分钟，然后收集上清液。
3. 以800 x g离心上清液15分钟，然后取上清液（约1,000 ml）。
4. 使用Minice Tangential Flow Filtration（TFF）胶囊系统通过超滤将上清液浓缩至30ml（约33倍浓度），在4℃下用100kDa截留膜（图3）。
  1. 从Minimate TFF胶囊的进料和滞留口中取出盖子。
    注意：不要丢弃上限。它们是存储所必需的。
  2. 将每个进纸/滞留端口中的一个公路由器 - 软管倒钩连接器（随附）拧入。
  3. 切割一块3.2毫米（1/8“）的管子，即长度足以从进料储存器通过泵头到达胶囊。
    注意：保持管道尽可能短，以减少系统滞留量。
  4. 将管道连接到其中一个进料口上的软管倒钩。将管道安装在泵头中。将管道的另一端放入水箱。
    注意：
    1. 如果使用压力表或换能器，将管道连接到压力装置。然后使用适当的连接器将压力设备尽可能靠近进料口进行连接。
    2. 进料和滞留端口是可互换的。根据胶囊的方向，选择位于最低高度的端口作为进纸口。这允许当液体泵送通过胶囊时空气容易排出。 Minimate TFF胶囊的推荐交叉流量为30-40 ml / min。
  5. 切割另一条管道，足够长的时间从滞留端口返回到样品池。
  6. 将管道连接到滞留软管 - 倒钩，并将另一端放在储存器中。（再次，如果使用压力表或传感器，管道连接到压力装置，然后必须连接到滞留端口。）
  7. 将滞留螺丝钳放置在靠近滞留端口的滞留管上（如果安装了压力表）。安全就位，但不要拧紧以限制管路。
  8. 取出一个滤液盖。
  9. 在其中一个滤液/排气口上安装一个女性鲁尔 - 软管 - 倒钩配件。
    
    注意：该浓度比基于随后的超速离心步骤的容量来选择。因此，浓缩比可以根据超速离心机（转子和管），细胞类型和培养条件而变化。
    
    图3. hMSC条件培养基的渗滤 A.切向流过滤（TFF）系统示意图; B.使用具有100kDa截留膜的Minimate TFF胶囊系统的渗滤系统的照片图像。
5. 为了丰富MV，使用蔗糖梯度离心浓缩上清液凝集。
6. 准备38毫升聚集管和0.8和2.7 M蔗糖垫（见配方2和3）。
7. 小心地将0.5ml的2.7M蔗糖放入管的底部。
8. 小心地加入0.8 M蔗糖1毫升正好高于2.7 M蔗糖层。允许蔗糖溶液在管壁内缓慢下降。
9. 在蔗糖垫上加入33ml样品，注意不要破坏蔗糖层（图4A）
10. 在4℃下将管以100,000×g离心1小时[转子：32Ti，加速度：最大，减速度：慢（9）]。
11. 离心后，从蔗糖级分富集的MV层中小心地去除上清液（约32ml）。
  注意：MVs仅在蔗糖垫上方（黄线，图4A），并且应该小心处理，因为用肉眼可以识别（图4B）。
  
  图4.通过蔗糖梯度超速离心富集微泡。A.通过在0.5ml 2.7M蔗糖密度溶液上分层1.5ml 0.8M蔗糖梯度来制备不连续的蔗糖密度梯度。接下来，仔细地将33ml浓缩条件培养基添加到顶部。 B.离心后，微泡在培养基和蔗糖层之间的界面富集
12. 准备OptiPrep ^{TM 溶液（参见配方4）和两个13.2 ml聚集管。}
13. 为了进一步纯化MV，将富含蔗糖级分的MV与OptiPrep TM（最终浓度= 30％）混合。
14. 将约2.5ml蔗糖级分转移至15ml管中
15. 加入1.34ml蔗糖稀释缓冲液至2.5ml富蔗糖馏分的MV，然后混合5.76ml 50％OptiPrep TM，以制备30％OptiPrep ^{TM（总体积：9.6ml）。}
16. 将4.8ml 30％OptiPrep ^{- 样品放入两个13.2ml聚集管中，每个。}
17. 加入3ml 20％OptiPrep ^{TM ，高于30％OptiPrep ^{TM 层，每个。}}
18. 在20％OptiPrep层的顶部加入2.5ml 5％OptiPrep ^{TM ，每个（图5A）。
  注意：注意！ OptiPrep ^{TM 具有低粘度，因此小心不要打扰或打破图层。
  
  图5.通过OptiPrep密度梯度分离微泡 A.在12ml管中制备不连续的OptiPrep ^{TM梯度，其中3层梯度由5％（2.5ml）的另外20％（3ml）和30％（4.8ml）储备OptiPrep ^{TM的另外的层。将储备溶液用20mM HEPES / 150mM NaCl缓冲液（pH7.2）稀释，并将样品溶液（来自蔗糖梯度的富含微泡的级分）与30％梯度溶液混合。 B.离心后，样品管被任意分成10等份，每份的1ml等分试样收集到新管中。在5％至20％OptiPrep ^{TM（F3层）之间的界面中清楚显示了主要的微泡级分。}}}}}
19. 在4℃下将样品管以200,000×g离心3小时（转子：SW41Ti）。
20. 离心后，将样品管分成10等份，分别取1ml。 MV在5-10％OptiPrep ^{TM之间的界面，显示白色带（F3层）（图5B）。}
21. 收集1ml MV（F3），用PBS稀释10倍（9ml），并在4℃下以100,000×g离心1小时（转子：SW41Ti）。
22. 离心后，确定管底部的颗粒。取出PBS并用100μlPBS溶解细粒
23. 使用折射计和Bradford染料测定法确定每个级分的蛋白质浓度注意：出于治疗目的，如果可能，最终产品的定量应表示为重量/ ml（或单位/ ml）。由于蛋白质是微泡的主要成分之一，所以使用蛋白质定量。或者，MV的定量可以通过流式细胞术，纳米粒子跟踪分析（NTA）或电阻脉冲检测与拉曼显微光谱结合来完成。

数据分析

基于以下测定法确定用于收获用于后续微泡分离的hMSC条件培养基的最佳时间点：

＆GT;通过流式细胞术分析（Annexin V-PI染色）测量90％的细胞活力。
蛋白质浓度通过二喹啉酸（BCA）测定

将脑提取物处理至目标hMSCs后，细胞形态发生明显变化（图6）

图6.未处理的hMSCs对脑提取物处理的hMSCs的细胞形态。未处理的hMSC; B. 20％正常脑提取物处理hMSCs; 20％脑卒中脑提取物治疗hMSCs。所有图像在中等替代后48小时获得。
为了量化未处理的MV和脑提取物处理的MV中的蛋白质浓度，通过Bradford方法测量样品（表1）。

表1.来自1L条件性MSCs培养基的的MV中的蛋白质量

笔记

根据MSC组织来源，MSC细胞密度，传代次数，培养持续时间和培养微环境（生物，化学或物理刺激），所得微泡的数量可以根据条件培养基收获和脑提取物的浓度而显着变化。 /> 经处理的数据和统计分析发表在Lee等人（2016），可以在以下网址找到： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5016792/

食谱

MSC培养基
DMEM低血糖
100 U / ml Pen / Strep（100x库存）
10％FBS
蔗糖稀释缓冲液
HEPES 20mM / 150mM NaCl缓冲液（pH7.2）
蔗糖垫
0.8 M蔗糖缓冲液：将5.48 g蔗糖溶于20ml蔗糖稀释缓冲液（pH 7.2）中，过滤，用0.45μm注射器过滤器灭菌，并在使用前在4°C储存。 2.7 M蔗糖缓冲液：将9.24 g蔗糖溶于10ml蔗糖稀释缓冲液（pH 7.2）中注意：将2.7M蔗糖预溶解于55℃烘箱中，用0.45μm注射器过滤器过滤，并在使用前在4℃下储存。
OptiPrep ^{TM 解决方案
均质培养基（HM）：0.25M蔗糖，蔗糖稀释缓冲液（pH7.4）
OptiPrep ^{TM工作溶液：0.25M蔗糖，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH7.4）
50％OptiPrep ^{TM：30ml（60％OptiPrep ^{25ml + OptiPrep ^{TM工作溶液5ml）
20％OptiPrep ^{TM：20ml（50％OptiPrep TM 8ml + HM培养基12ml）
5％OptiPrep ^{TM：20ml（50％OptiPrep ^{2ml + HM培养基18ml）}}}}}}}}

致谢

该方案改编自“来自脑提取物处理的间充质干细胞的微泡改善缺血性卒中大鼠模型中的神经功能”（Lee等人，2016）。这项工作得到了Bio＆amp;由韩国政府资助的国家研究基金会（NRF）医疗技术发展计划，第2012M3A9B4028639号。

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