材料和试剂

移液器提示
培养皿60 x 15 mm 500 / cs（Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
无菌150×20mm培养管（Sigma-Aldrich，目录号：C1048）
无菌150 x 16毫米培养管（科学实验室用品，目录号：6135-5-012）
1.5 ml管子
Amicon Ultra 0.5 ml离心过滤器MWCO 10 kDa（Sigma-Aldrich，目录号：Z677108）
制造商：EMD Millipore，目录号：UFC501096。
Amicon Ultra离心过滤器Ultra-4，MWCO 30 kDa（Sigma-Aldrich，目录号：Z648035）
制造商：EMD Millipore，目录号：UFC803024。
Cryovial（Simport，目录号：T310-2A）
96孔固体板（比色法）（Cayman Chemical，目录号：400014）
96孔盖板（Cayman Chemical，目录号：400012）
B的衍生物。 subtilis NCIB31610
枯草芽孢杆菌NCIB3610和JH642（基因组库，目录号：3A1和1A96）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
Bacto蛋白胨（BD，Bacto ^{TM ，目录号：211677）}
硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒（Cayman Chemical，目录号：780001）
硝酸盐/亚硝酸盐测定缓冲液（Cayman Chemical，目录号：780022）
硝酸还原酶制剂（Cayman Chemical，目录号：780010）
硝酸还原酶辅助因子制剂（Cayman Chemical，目录号：780012）
硝酸盐标准品（开曼化学，目录号：780016）
Griess Reagent R1（Cayman Chemical，目录号：780018）
Griess Reagent R2（开曼化学公司，目录号：780020）
Luria Bertani肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
Luria Bertani肉汤用琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P2222）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
MOPS（Sigma-Aldrich，目录号：M9381）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
氯化锰（II）（MnCl 2·2H 2 O）（EMD Millipore，目录号：1059340100）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：236489）
谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：49621）
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N1127）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：223484）
10 N NaOH
线虫生长培养基（NGM）肉汤（见食谱）
MSGG媒体（见食谱）
5 mg / ml氯霉素（见配方）
5 mg / ml胆固醇（参见食谱）
1 M MgSO 4（参见食谱）
1 M CaCl 2 （见配方）
磷酸盐缓冲液（见配方）
Z缓冲（见配方）
10 mg / ml溶菌酶溶液（见配方）
10％Triton X-100溶液（参见食谱）
O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）4.5mg / ml（参见食谱）
1.2 M Na 2 CO 3（参见食谱）
50％甘油（参见食谱）
100mM MOPS pH = 7（参见食谱）

设备

锥形瓶（Fisher Scientific，目录号：FB5006000）
Pipettor（Gilson，目录号：F167300）
玻璃移液管
冷藏培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：51028064; Fisher Scientific，目录号：37-20）
注意：产品“Fisher Scientific，目录号：37-20”已停产。}
水浴（AQUA ^{® LYTIC孵化器37°C）}
冷冻机（-20°C;低环境设备）（西门子，型号：So-Low Ultra C85-22）
高压灭菌器（Tuttnauer，型号：6690型）
搅拌电热板（康宁，目录号：6795-620）
离心机（Eppendorf，型号：5430）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
分子动力学模型SpectraMAX 340 PC酶标仪（Molecular Devices，型号：SpectraMAX 340PC384）

程序

B的准备。枯草芽孢杆菌菌株培养物
1. 使用无菌程序，在无菌150 x 20 mm管中加入2 ml无菌MSGG或NGM肉汤（见食谱）。接种20微升B的培养基。枯草芽孢杆菌菌株冷冻培养物（JH642或NCIB3610）（见注3）。对于NGM肉汤的制备，将3g NaCl和2.5g细菌蛋白胨混合在锥形瓶中。加入1L dH 2 O。在121℃高压灭菌20分钟。在55℃水浴中冷却烧瓶15分钟。加入1ml 1M CaCl 2，1ml 5mg / ml胆固醇的乙醇溶液，1ml 1M MgSO 4和25ml 1M KPO 4 / sub>缓冲区。旋转混匀。
2. 在37℃下振荡孵育16-18小时（过夜培养）。
B的准备。枯草芽孢杆菌菌株培养支持生物膜形成
1. 使用无菌程序，在无菌150 x 16 mm管中加入2 ml无菌MSGG或NGM肉汤。接种20微升B的培养基。枯草芽孢杆菌菌株过夜培养。
2. 在25℃下孵育36小时（浮游条件）或不摇动（生物膜支持条件）（见注4）。
B的准备。枯草芽孢杆菌菌株样品进行NO测定（根据试剂盒说明书）
1. 取管并通过涡旋破坏生物膜，直到获得均匀的悬浮液。对于CFU（集落形成单位）计数取100μl等分试样（见注1）
2. 以12,470×g离心20分钟。将上清液转移到无菌的1.5ml Eppendorf管中，弃去沉淀。
3. 使用市售的离心机使用10或30kDa分子量截止滤器的超滤器。过滤器应在超滤前用超纯水进行预漂洗。
4. 等待3小时，将硝酸盐转化成亚硝酸盐所需的时间。
制备标准曲线（根据试剂盒的说明）
1. 必须包括硝酸盐和亚硝酸盐的标准曲线。如果计划只测量总NO产物（硝酸盐+亚硝酸盐），则只需要硝酸盐标准曲线。
2. 在干净的管子中，从试剂盒中加入0.9ml'硝酸盐分析缓冲液'。加入0.1ml重构的“硝酸盐标准液”，涡旋20秒。该库存标准的浓度为200μM
3. 使用本标准制备硝酸盐标准曲线，如下所述。通过以下列方式向板孔中加入试剂制备硝酸盐的标准曲线（图1）：
  
  图1.根据试剂盒说明书制备硝酸盐标准曲线
进行测定（根据试剂盒说明）
1. 向空白孔中加入200μl水或“硝酸盐分析缓冲液”。不要在这些井中添加任何其他试剂。
2. 以您选择的图案将最多80μl样品加入孔中。使用“硝酸盐分析缓冲液”解决方案，最终体积必须调至80μl
3. 向每个孔（标准品和未知）中加入10μl“酶辅因子混合物”（见附注6）。
4. 向每个孔中加入10μl“硝酸还原酶混合物”（标准品和未知数）。
5. 用板盖盖板，室温孵育2小时。孵化期间无需摇动板。
6. 孵育时间后，向每个孔（标准品和未知）中加入50μl“Griess Reagent R1”（见注7）。移动上下2-3次。
7. 孵育时间后，向每个孔（标准品和未知）中加入50μl“Griess Reagent R2”（见注7）。移动上下2-3次。
8. 允许颜色在室温下培养10分钟。不需要盖板。
9. 使用读卡器读取540nm处的吸光度。
计算
1. 从所有其他孔的吸光度值中减去空白孔的吸光度值。
2. 作为硝酸盐浓度的函数，绘制540 nm处的吸光度图。硝酸盐标准曲线用于测定总硝酸盐+亚硝酸盐浓度。一个例子如图2所示
3. 计算NO浓度如下：（硝酸盐+亚硝酸盐）（μM）=（[A 540] -y-截距）/斜率]×（200μl/使用体积（μl））×稀释< br />
4. 根据在步骤C1中获得的CFU，将NO（μM）归一化为1×10 <8> CFU。
  
  图2.典型的标准曲线（根据套件说明）
β-半乳糖苷酶活性的测定（Arabolaza et al。，2003）（见附注5）
1. 本研究中使用的细菌菌株是B型的衍生物。在非必需的amyE基因座上整合到细菌染色体中的含有P csf 融合在一起的NCIB31610。
2. 将2ml MSGG或NGM肉汤无菌地引入先前高压灭菌的150×16mm培养管和2μl5mg / ml氯霉素中。
3. 每个管子用20μl的过夜培养物接种;仅含MSGG或NGM肉汤的未接种管作为交叉污染对照。
4. 将培养物以130rpm（浮游条件）或不摇动（生物膜支持条件）置于旋转振荡器上，并在37℃下温育。
5. 将管孵育至少36小时。为了确定培养物的密度，取管并通过涡旋破坏生物膜，直至获得均匀的悬浮液。取100μl等份进行CFU计数（见注1）。使用Molecular Dynamics Model SpectraMAX 340PC酶标仪来确定稀释培养物的A 525（1/10稀释度）。如下所述，需要稀释培养物，因为当值高于0.8-1时，细胞密度不与A 525成比例。
6. 通过加入2μl5mg / ml氯霉素（参见Recipes），使用中间移液器将两个等分的来自破碎培养物的1ml等分试样停止，并将管置于冰上。然后离心1.5ml Eppendorf管，在4℃下以12,470×g离心5分钟。去除上清液并将沉淀物在-20℃下冷冻或立即测定（参见附注2）（图3）。
  
  图3.流程图图，显示在浮游生物膜支持条件和样品收集中培养细菌的基本步骤
7. 对于细胞透化，将0.73ml Z缓冲液（参见食谱）分配到沉淀中。
8. 含有0.73ml Z缓冲液的试剂空白与未知数一起运行。
9. 加入10μl10 mg / ml新鲜溶菌酶溶液（参见食谱）到管中，并在37°C水浴中孵育15 min。
10. 将试管转移到试验台上，加入10μl10％Triton X-100（参见食谱）。通过吸入和分配混合物10次来实现渗透性。
11. 渗透后立即在零时，通过向每个管中加入100μl的4.5mg / ml ONPG（参见食谱）开始测定。在测定结束时，将管在28℃温育适合的时间长度，例如15分钟，然后在反应终止之前，加入150μl的1.2M Na 2 sub> 2 <3> 3 （参见食谱）。
12. 然后，将管的内容物转移到微孔板中，将微孔板引入读数器，并确定Aβ420值。
13. 以米勒单位（M.U.）表示的β-半乳糖苷酶活性的计算如下进行：
  
  亩。 =（OD 420×66.7）/（OD 525×ml使用）
  
  其中，
  OD 420是β-gal测定的光密度，
  OD 525是细菌培养物的光密度，
  66.7是修正因子，
  ml是用于重悬细菌沉淀的Z缓冲液的体积（在这种情况下为0.73ml）
14. 根据步骤C1中获得的UFC，将β-gal（M.U.）归一化为1×10 <8> UFC。

数据分析

将A 420和A 525的吸光度数据转移到Microsoft Excel电子表格，并计算米勒单位中的β-半乳糖苷酶特异活性。
每次测定应重复至少三次，一式四份。
使用学生的 t -test具有重要性截止级别 P 0.05用于比较两组之间。
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行多重比较。

笔记

对于用于种子枯草芽孢杆菌的LB板，我们强烈建议在45℃下干燥板20分钟或37℃反复40分钟，然后将稀释液放入每个板上以避免这种细菌在固体表面滑动，水滴从冷凝水中脱落
应立即使用样品或-20°C储存1个月。
LB琼脂平板上的细菌可以在4℃下储存数周。然而，长期储存时，建议制备甘油储备。甘油的加入使冷冻细菌稳定，防止细胞膜损伤并保持细胞活力。甘油储存的细菌可以稳定地储存在-80℃多年。为此，准备过夜的细菌培养物，将500μl的过夜培养物加入到500μl50％甘油（参见食谱）中，在2ml冷冻浴中轻轻混匀。在-80℃下冷冻甘油储备管。现货现货稳定多年，只要保持在-80°C。随后的冻结和解冻周期将降低保质期。要从您的甘油原料中回收细菌，请打开管子，并使用无菌环或移液管尖端刮去顶部的一些冷冻细菌。不要让甘油股解冻。在执行程序时，始终将甘油储存在冰上。将细菌连接到LB琼脂平板上。在37℃下使枯草芽孢杆菌生长过夜。
为了在浮游条件下孵育，用细菌过夜培养物接种的管应在130rpm下摇动时保持在45°位置。为了在生物膜支持条件下孵育，用细菌过夜培养物接种的管子应保持垂直位置而不摇动。
已经使用枯草芽孢杆菌制定了这些参数，并且用其他细菌获得的结果可能不准确。
“硝酸还原酶辅因子混合物”对光敏感。防光。使用过程中保持冰。不使用时在-20°C储存。
“Griess试剂R1”和“Griess Reagent R2”对光敏感。防止光线，尤其是阳光。不使用时在4°C储存。

食谱

线虫生长培养基（NGM）肉汤

将3g NaCl和2.5g细菌蛋白胨溶解于1L dH 2 O中，
高压灭菌器
在室温下存放

MSGG媒体

溶解17.4g K 2 H 2 HPO 4，13.6g KH 2 PO 4，20.9g MOPS，18.3g MgSO 4七水合物，11g CaCl 2二水合物，3.1g MnCl 2二水合物，40.2ml甘油，0.6g FeCl 3 六水合物，20g谷氨酸盐，1g色氨酸，1g苯丙氨酸加到100ml dH 2 O中，
高压灭菌器
在室温下存放

5毫克/毫升氯霉素

将0.05克氯霉素溶于10ml 100％乙醇中
储存于4°C

5毫克/毫升胆固醇

将0.25g胆固醇溶于50ml 100％乙醇中
不要高压
在室温下存放

1M MgSO 4

将6g硫酸镁四水合物溶于50ml dH 2 O中，
高压灭菌器
在室温下存放

1M CaCl 2

将5.55g CaCl 2二水合物溶于50ml dH 2 O中，
高压灭菌器
在室温下存放

磷酸盐缓冲液

将10.7g K 2 N 2 HPO 4和32.5g KH 2 PO 4溶解至300ml dH 3 2 O
调节pH至6.0
高压灭菌器
在室温下存放

Z缓冲区

溶解2.55g Na 2 HPO 4，1.44g NaH 2 PO 4，0.22g KCl，0.074 MgSO 4，亚> 4个七水合物和1,050μlβ-巯基乙醇加到300ml dH 2 O中，
在室温下存放

10mg / ml溶菌酶溶液

将10毫克溶菌酶溶解于1毫升dH 2 O - / -
储存于4°C

10％Triton X-100溶液

将1ml Triton X-100溶解至10ml dH 2 O→/
在室温下存放

O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）4.5mg / ml

将0.225g ONPG溶解在50ml的dH 2 O中
储存于-20°C。使用直到黄色发展为

1.2M Na 2 CO 3 3

将6.36g Na 2 CO 3溶解至50ml dH 2 O→
储存于4°C

50％甘油

将25毫升100％甘油溶解于25毫升dH 2 O - / -
高压灭菌器
在室温下存放

100mM MOPS pH = 7

将20.93g MOPS溶解在80ml dH 2 O中
用10N NaOH调节pH至所需值
使用dH <2> O
将体积增加至100ml
过滤灭菌

致谢

这项工作得到了CONICET（Consejo Nacional de InvestigacionesCientíficasyTécnicas）和FONCyT（Fondo para laInvestigaciónCientíficayTecnológica）的支持，在拉丁美洲生物科学计划（Philadelphia，PA，USA），富布莱特委员会（华盛顿特区，美国）和前基督教基金会（阿根廷布宜诺斯艾利斯）。我们调整了来自Arabolaza等人的β-半乳糖苷酶活性的测定。（2003）。

参考

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