材料和试剂

移液器提示
离心管
6孔培养板
HiBindTM DNA迷你柱
羊（健康的母羊[3-5岁]被选中约160）
PGL3-U6-gRNA载体（Addgene，目录号：51133）
pUC57-T7-gRNA载体（Addgene，目录号：51132）
电子。大肠杆菌DH5α感受态细胞
Cas9 mRNA体外转录载体（Addgene，目录号：44758）
T载体（Takara Bio，目录号：D103A）
Bsa l酶（New England Biolabs，目录号：R3535）
DNA凝胶提取试剂盒（Corning，目录号：D205-04）
T4连接酶（New England Biolabs）
氨苄青霉素
EndoFree Plasmid Maxi Kit（QIAGEN，目录号：12362）
引物

M13R（-47）底漆
5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'
用于放大选定的潜在离靶位点的引物，由Primer5软件设计。

乙醇
冰醋酸（广州化学试剂厂，目录号：CB39-GR-0.5L）
Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ）}
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ）}
Lipofectamine3000试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM ）}
Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ）}
杀虫剂S盐酸盐
通用基因组DNA试剂盒（CWBIO，目录号：CW2298M）
KOD-Plus-Neo
PCR清除试剂盒（AppliChem，目录号：A7089,1000）
T7EI
琼脂糖
TCM199培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ）}
Quinn的优势切割介质和囊胚培养基（Sage Biopharma）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific）
REPLI-g单电池套件（QIAGEN，目录号：150343）
D2000 DNA标记
Tris
乙二胺四乙酸（EDTA）
琼脂粉末
胰蛋白胨
酵母提取物
氯化钠（NaCl）
50x TAE（见配方）
LB培养基（见食谱）

设备

移液器
37°C水浴
热循环仪（Bio-Rad thermocycler）
DNA电泳仪
微量离心机
Eppendorf FemtoJect系统
奥林巴斯微操作系统ON3（奥林巴斯，型号：ON3系列）
显微注射装置
活检钳（Olympus，型号：FB-11K-1）

软件

Primer5软件

程序

sgRNA设计
1. 选择羊基因组中的特定目标位点，然后设计sgRNA-寡核苷酸序列
2. 在设计sgRNA-oligo序列后，应加入适当的衔接子序列进行克隆。 pUC57-T7-gRNA载体和PGL3-U6-gRNA的上游引物应包括5'-TAGG-3'衔接子序列，而两者的下游引物应包含具有5'-AAAC-3' 。

构建sgRNA-Cas9质粒

通过Bsa I来消化PGL3-U6-gRNA载体和pUC57-T7-gRNA载体。
在37°C孵育3-4小时。
使用DNA凝胶提取试剂盒纯化消化的载体

双链序列并制备双链寡DNA反应体系：

MSTN:	sgRNA1:	5’ CCAACTGTGGATATATCTGAGAC 3’
		5’ GTCTCAGATATATCCACAGTTGG 3’
	sgRNA2:	5’ GGATTTTGAAGCTTTTGGATGG 3’
		5’ CCATCCAAAAGCTTCAAAATCC 3’
ASIP:	sgRNA1:	5’ CCAGAGATGAAAGGAACCTGAAG 3’
		5’ CTTCAGGTTCCTTTCATCTCTGG 3’
	sgRNA2:	5’ CAATTCTTCCATGAACCTGTTGG 3’
		5’ CCAACAGGTTCATGGAAGAATTG 3’
BCO2:	sgRNA1:	5’ CCATGCATTGCACCGCTTCTAAC 3’
		5’ GTTAGAAGCGGTGCAATGCATGG 3’
	sgRNA2:	5’ GGTCGTCTCAGCTCGAGTCCAGG 3’
		5’ CCTGGACTCGAGCTGAGACGACC 3’

使用以下循环条件进行PCR：
用通过Bsa I消化的PGL3-U6-gRNA载体来连接稀释的双链寡核苷酸：
在16℃下孵育过夜。
将1μl连接产物转化成50μlE.大肠杆菌DH5α感受态细胞。
取一个菌落并接种在含有50μg/ ml氨苄青霉素（每个转化4个菌落）的5ml LB培养基的15ml管中。在37°C振荡器中孵育过夜。
使用Endo-Free Plasmid Mini Kit从转化的DH5α细胞中提取质粒，遵循制造商的说明（参见补充1 ）。

使用M13R（-47）引物，通过Sanger测序确认含有PGL3-U6-gRNA和pUC57-T7-gRNA的阳性克隆。

绵羊成纤维细胞Cas9 / sgRNA功效试验

绵羊成纤维细胞从40天龄的胎儿获得，然后运送到实验室。
在补充有10％FBS（Gibco）和1％青霉素 - 链霉素（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）中将成纤维细胞培养5代，直到80-90％汇合。
细胞转染。
1. 根据说明书（表1），使用Lipofectamine3000试剂（Invitrogen）进行转染过程。
  
  表1.使用Lipofectamine3000试剂（Invitrogen）进行转染的规范
2. 成纤维细胞分别转染为以下类型：
转染24小时后，向培养基中加入10mg / ml杀稻瘟素S盐酸盐稀释至稀释液（1：1,000）。
然后在37°C孵育24 h
使用通用基因组DNA试剂盒转染后72 h，从成纤维细胞中提取基因组DNA
使用KOD聚合酶扩增靶向片段，然后用PCR清除试剂盒进行纯化。
1. 用于扩增靶向MSTN ，ASIP 和/或BCO2 片段的Cas9 / sgRNA的引物。
2. 如下制备反应混合物：
3. 使用以下条件进行PCR [退火温度（T）和延长时间（L）]
纯化的PCR产物在NEBuffer 2（NEB）中使用Bio-Rad热循环仪进行变性和再退火。
PCR产物在37℃下用T7EI消化30分钟，并通过2.5％琼脂糖凝胶电泳分离。
通过T7EI切割测定检测到的突变的PCR产物被亚克隆到T载体中
对于每个样品，随机挑选菌落并使用M13F（-47）测序以确认阳性菌落。

羊成纤维细胞中的脱靶检测
1. 然后将PCR产物进行如上所述的T7EI切割测定，结果如下（图1）
  
  图1. sgRNA的检测：Cas9介导的off靶标切割 MSTN ，通过使用T7EI切割测定法，强> ASIP 和 BCO2 来自绵羊成纤维细胞（A和B）的MSTN，ASIP 和bCO2 sgRNA：Cas9位点的潜在off靶位点的PCR产物。与MSTN ，ASIP 和 BCO2 sgRNAs最相似的off-靶位点的预测命名为OT1至OT17。 C和D.通过使用T7EI切割测定法检测sgRNA：Cas9介导的MSTN ，ASIP 和/或BCO2靶向切割。更多消息请参阅 Wang 等。（2016）。

合辑集合
注意：选择健康的母羊（3-5岁）作为合适的受精卵供体，包括定期发情周期。

献血者的合子收集和治疗如前所述在山羊中进行（Wang等人，2015）。
使用外科手术收集一个细胞阶段受精卵（最后一次授精约10-16小时），并立即将收集的合子转移到TCM199培养基中。

有效检测羊受精卵

显微注射sgRNA＆amp;在加热平台上的操作介质TCM199中使用Olympus显微操作系统ON3将Cas9 mRNA转入羊合子。
注意：将针对MSTN，ASIP和BCO2的Cas9 mRNA（20ng /μl）和sgRNA（针对每个sgRNA的5ng /μl）混合。/ / em>
注射sgRNA和Cas9 mRNA使用Eppendorf FemtoJect系统进入受精卵细胞的细胞质，并进行以下设置：
在Quinn的优势切割培养基和胚泡培养基（Sage Biopharma）中，将胚胎在38.5℃培养168小时。
胚胎胚胎用于在PBS中保存的有效检测。
使用REPLI-g单细胞试剂盒扩增胚胎基因组。
如上所述扩增靶向片段，包括引物，反应和程序
PCR产物的纯化，T7EI切割测定和Sanger测序根据Wang等人（2015）进行。

基因修饰羊的生产
注意：基因修饰的羊和对照动物喂食相同的饮食，并在整个实验中在相同的条件下进行管理。

选择以自然发情循环为代表的代孕母羊。
如上所述进行给药者的合子收集和治疗。
使用Quinn的优势切割培养基（Sage Biopharma），将受精卵在37℃下培养24小时。
然后在Quinn的优势囊胚培养基（Sage Biopharma）中培养受精卵，37℃，5％CO 2和饱和湿度。
大约3-4个分裂的胚胎被移植到接受母羊的输卵管的壶腹 - 交界处。
妊娠期Tan羊通常需要约150天，根据每个排卵周期的发情行为情况确定。

遗传修饰羊的效率检测
1. 结果可以证实基因修饰的羊的突变。（图2）
  
  图2. sgRNA的评估：Cas9介导的羔羊遗传修饰。：一种。用Cas9 mRNA和sgRNA的混合物共同显微注射的创始人羊的MSTN ，，ASIP 和 BCO2 基因的目标区域的PCR产物。 D2000 DNA标记用作标记参考。 B.通过使用T7EI切割测定法检测sgRNA：Cas9介导的MSTN，ASIP和/或BCO2基因的目标上切割。将来自（A）的所有PCR产物进行T7EI切割测定。 C.在创始人动物中检测到的经修改的MSTN ， ASIP 和 BCO2 基因座的测序结果。与目标基因的sgRNA互补的靶序列是红色文本，而PAM序列标记为绿色。突变标记为蓝色，短划线表示缺失，小写表示插入或替换。插入（+），缺失（ - ），突变（m）显示在每个等位基因的右侧。基因型显示为右侧与TA测序的总克隆的比率。有关更多信息，请参阅 Wang 等。（2016）

种系传播检测

通过使用活检钳获得三名创始人（＃28，＃33和＃37）睾丸的生殖细胞。
使用REPLI-g单细胞试剂盒扩增生殖细胞的基因组。
使用T7EI切割测定法检测具有突变的PCR产物，随后进行Sanger测序。

食谱

50倍TAE
将242g Tris，37.2g EDTA溶解在700ml dH 2 O中，/ / 注意：将溶液加热至60°C以帮助溶解。
加入57.1毫升冰醋酸将dH _{2 O添加到1,000 ml
然后，将200ml溶液通过加入10μLdH 2 O→/}
LB培养基
将2g琼脂粉末，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，1g NaCl的200ml dH 2 O

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（31372279,31402038和31171377），中国转基因生物新品种重大项目（2014ZX08008-002）以及中国农业科研体系（CARS-40）的支持。 -13）。

参考

Wang，X.，Niu，Y.，Zhou，J.，Yu，H.，Kou，Q.，Lei，A.，Zhao，X.，Yan，H.，Cai，B.，Shen， Zhou，S.，Zhu，H.，Zhou，G.，Niu，W.，Hua，J.，Jiang，Y.，Huang，X.，Ma，B. and Chen，Y。（2016）通过CRISPR / Cas9进行多重基因编辑显示出所需的肌肉肥大，无需检测 - 羊的目标效应。 Sci Rep 6 ：32271.

Wang，X.，Yu，H.，Lei，A.，Zhou，J.，Zeng，W.，Zhu，H.，Dong，Z.，Niu，Y.，Shi，B.，Cai， Liu，J.，Huang，S.，Yan，H.，Zhao，X.，Zhou，G.，He，X.，Chen，X.，Yang，Y.，Jiang，Y.，Shi， Tian，X.，Wang，Y.，Ma，B.，Huang，X.，Qu，L. and Chen，Y。（2015）。通过合格注射CRISPR生成靶向MSTN 和 FGF5 的基因修饰山羊/ Cas9系统。 Sci Rep 5：13878.