材料和试剂

Eppendorf管（1.5毫升）
无菌提示
塑料包装（Bemis，目录号：PM996）
130 x 130 x 12 mm方形塑料板（自制，见图1）
130 x 13 x 2 mm玻璃条（自制，见图1）

图1.用于治疗的方形塑料板
拟南芥种子（DR5：GUS 线，Col-0背景）
蒸馏水
乙醇（国药化学试剂，目录号：80176961）
次氯酸钠（NaClO）（国药化学试剂，目录号：80010428）
十二烷基硫酸钠，钠盐（SDS）（国药化学试剂，目录号：30166428）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（国药化学试剂，目录号：10017618）
硝酸钠（NaNO 3）（国药化学试剂，目录号：10019918）
硫酸镁（MgSO 4）（国药化学试剂，目录号：10013018）
氯化钙（CaCl 2）（国药化学试剂，目录号：20011160）
硫酸亚铁（FeSO 4·7H 2 O）（国药化学试剂，目录号：10012116）
戊二胺四乙酸（EDTA）（国药化学试剂，目录号：10009717）
硼酸（H 3 3 BO 3）（国药化学试剂，目录号：10004818）
硫酸锰（MnSO 4）（国药化学试剂，目录号：LB2208102）
氯化锌（ZnCl 2）（国药化学试剂，目录号：10023828）
硫酸铜（CuSO 4）（国药化学试剂，目录号：10008216）
钼酸钠（Na 2 MoO 4）（国药化学试剂，目录号：10019818）
蔗糖（国药化学试剂，目录号：10021418）
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002）
种子灭菌方案（见食谱）
正常生长培养基（参见食谱）
Fe补充培养基和对照培养基（参见食谱）
控制介质（见配方）

设备

玻璃瓶（Schott Duran玻璃瓶，500毫升以上容量）/ /
孵育室（23±1℃，荧光灯以100μmol/ m 2 /秒以下，16小时/ 8小时黑暗）
pH计（Mettler-Toledo International，型号：FE20K）
高压灭菌器（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：SX-500）
冰箱（海尔，型号：BCD-648WDBE）
流量罩（苏州安泰空气科技，型号：SW-CJ-1F（D））
漩涡
镊子

程序

需要以下介质（参见食谱部分）：（a）正常生长培养基，用于种子发芽，（b）含有50μMFe-EDTA的对照培养基和（c）含有350μMFe-EDTA的Fe补充培养基。
种子灭菌和种子电镀。

将5mg（200-300粒种子）的拟南芥种子放入Eppendorf管中，加入750μl灭菌溶液（参见食谱）。
在室温下涡旋1分钟。
在流动罩下倒置灭菌溶液（无菌提示），并加入750μl无菌水以洗涤种子。
短暂旋涡并滗出水。
重复洗涤步骤5次。
在无菌正常生长培养基平板上播种种子。接下来关闭并用塑料包装密封板。
在23℃的生长室中以16小时/ 8小时黑暗的循环（150μmol/平方米以上）向上孵育板垂直位置。 >）。
种植幼苗5-7天（主根长约2厘米）。

全根和局部根部供应过量的铁。

准备板（参见图2），每次处理需要至少三次复制（平板）。

图2.准备待处理的板。将玻璃条和镊子高压灭菌。将玻璃棒放在培养皿中，用镊子，玻璃棒必须紧紧地固定在气隙中。
制备用于均匀和局部Fe处理的琼脂培养基。琼脂培养基首先在液体循环121℃下高压灭菌20分钟。 Fe补充介质可以设置如下。对于（I）均匀的Fe补充培养基，将处理介质均匀铺展（图3C）。对于（II）'根尖 - 补充Fe的培养基'，使用分割成上部和底部的分段琼脂板，其间距为3毫米，气隙为3毫米宽的可移动玻璃条。将控制介质倒入上部，将Fe补充介质倒入底部（图3D）。对于（III）“补充培养基的培养基”，将控制培养基倒入底部，并将Fe补充培养基倒入上部（图3E）。 Fe补充培养基（350μMFe-EDTA）和对照培养基（50μMFe-EDTA）的组成与正常生长培养基相似，但pH为5.3。

图3.制备对照和Fe补充培养基的实验装置。控制介质显示为浅灰色;补铁介质呈灰暗色。
对于Fe处理幼苗。将幼苗（“DR5：GUS”系列）发芽5至7天，然后用镊子将其转移到补充Fe的培养基中（轻轻搅拌幼苗，但不要接种）（图4A）。对于“根尖提供的”植物，安排使得只有幼苗的主要根尖（〜2mm）与培养基的底部接触被称为“根尖提供的Fe”植物（图4B）。对于“笋提供的Fe”植物，布置使得幼苗的芽和成熟主根区与培养基的上部接触。治疗的持续时间为5天。所有启动事件，包括出现的LR和LRP都使用DR5：GUS 行进行量化（图4C和4D）。

图4.在拟南芥中局部供应Fe对LR起始的影响 A.将过量Fe施用于根部与根尖的实验装置的示意图芽成熟根连续体。白色部分表示具有对照培养基的基础生长培养基，灰色部分表示Fe补充培养基（350μMFe-EDTA）。 B.转移到最终媒体后的幼苗图片C.在显微镜下观察到的侧根的图像（Zhang等人，1999）; D.当地供应的铁对LR启动的影响在5天。价值是6植物±SE的手段。 Ctrl，控制媒体。

数据分析

治疗后，在解剖显微镜下计算侧根发生事件的数量。每个侧根原基（LRP）的发育阶段根据Zhang等人（1999）分为以下阶段：阶段A，最多三个细胞层;阶段B，未通过，超过三个细胞层;阶段C，出现LR，长度小于0.5毫米;和阶段D，LRs大于0.5毫米。出现但未激活的LRP仍被称为LRP，只有成熟的LR（长度超过0.5mm）被表示为LR（图4C）。侧根发生事件的数量是阶段A + B + C + D（图4D）。

笔记

从种子灭菌步骤开始，所有的操作都必须在干净的工作台上进行
将玻璃棒放在培养皿中的步骤：首先，玻璃棒和镊子必须是无菌的;其次，玻璃棒必须使用镊子放置在培养皿的凹槽（气隙）中。所有操作必须在干净的工作台上进行。
在图3D和3E中，在转到步骤3之前，您必须等待第2步的琼脂在上部固化。类似地，在转到步骤4之前，等待步骤3中的琼脂在底部固化。

食谱

种子灭菌解决方案
75％（v / v）乙醇 10％（v / v）NaClO
0.1％（w / v）SDS
正常生长培养基
Fe补充培养基
补充有350μMFe-EDTA的正常生长培养基用1N NaOH调节pH至5.3
控制媒介
补充50μMFe-EDTA的正常生长培养基用1N NaOH调节pH至5.3

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（31430095）和中国科学院创新计划（CAS ISSASIP1604）的支持。该协议由Li等人，2015a修改。

参考

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