材料和试剂

无菌一次性过滤器（0.22μm孔径，aPES膜19.6cm 2），CA膜）（例如Corning 250ml真空过滤器/储存瓶系统，Corning，目录号： 430767）
硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.50 mm，ID 0.86 mm）（Sutter Instrument，目录号：BF150-86-10）
无长丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（OD 1.50 mm，ID 0.86 mm）（Sutter Instrument，目录号：B150-86-10）
银线（A-M系统，目录号：782000）
金刚石涂层台板石（如Dia-Sharp台阶上的DMT 8）
绘出P200提示
10ml注射器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：S7510-10）
Minutien针（精细科学工具，目录号：26002-10）
精美油漆刷
所需基因型和年龄的苍蝇
注意：通过使用E49-Gal4驱动程序（来自Ulrike Heberlein的Gal4系列的E49-Gal4），可以在CM9运动神经元内驱动UAS构建体。
50％漂白
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-250G）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：21115-250ML）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：63069-500ML）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761-500G）
海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：T9531-25G）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-25G）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097-250G）
修饰的血淋巴样溶液（HL3.1）（见食谱）

设备

万纳斯弹簧剪刀-2毫米刀刃（精细科学工具，目录号：15000-03）
钨解剖针125毫米，超细（Roboz手术器械，目录号：RS-6063）
微型解剖针架5¼“（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-6060）
精镊子（如Dumont＃5CO，Fine Science Tools，目录号：11295-20和Dumont＃3，Fine Science Tools，目录号：11231-30）
解剖立体变焦显微镜（如ZEISS，型号：SteREO Discovery.V8）
窄格式机械手系统（如Sutter Instrument，型号：ROE-200）
水平式微量拔管器（如可编程火焰/棕色型微量吸管拔出器，Sutter Instrument，型号：P-97）
微锻电极抛光机（如NARISHIGE，型号：MF-900）
直立共焦显微镜（如奥林巴斯，型号：BXS1WI），具有10x和40x水位目标
电力实验室4/30数字转换器（AD仪器，型号：ML866）
Neuroprobe放大器1600（A-M系统，型号：1600型，目录号：680100）
刺激器（Digitimer，型号：DS2A）
Labchart 7（AD仪器）

软件

Prism 6（GraphPad软件）
迷你分析（可比版本6.0.3，Synaptosoft Inc.）

程序

准备氯化银线
将银线放在50％漂白/ 50％ddH 2 O溶液中，使至少3/4的线浸入液体中。将电线留在漂白/水溶液中约5分钟，以便发生足够的氯化
准备记录电极 - 参见2008年的Brown Joe视频“使用可编程拉杆进行贴片移液器和锋利的电极”。参考（见注释）。

将一根氯化银线插入电极支架，确保灯丝的端部接触支架的金属底部。
小心地将玻璃毛细管插入微量移液器拉拔器，并设置拉拔程序以填充3 M KCl时，产生足够的尖端尺寸和30MΩ内阻的移液器。这些参数可以通过使用可编程P-97 Flaming / Brown拉拔器来实现（图1B）（见注释）。

图1.制备的电极。 A.代表性的吸电极抛光至〜12-15μmI.D. B.使用注释中所示的参数拉出代表性记录电极。
用3 M KCl装入细长尖端注射器，并将足够的氯化钾分配到玻璃毛细管中，以充分回填尖端。一旦尖端有足够的KCl就位，用足够的氯化钾填充玻璃毛细管，以确保电极至少半满。
将氯化银线滑入玻璃毛细管，确保浸入KCl中。
将记录电极插入将用于接地的电极显微操纵器（图5.2）。

准备吸电极
1. 小心地将玻璃毛细管插入微量拔出器，并将拉丝器程序设置为具有足够的尖端尺寸的移液器。通常，用于创建记录电极的参数也可用于制造吸电极。
2. 使用金刚石涂层台板（粗面）充分破裂尖端，使得产生〜30μm的平坦开口。
3. 热抛光电极尖以减少I.D.至〜12-15μm。需要抛光才能产生足够的锥度，以确保CM9 MN在记录过程中不会从电极中脱出，从而在CM9 MN周围提供足够的密封（图1A）。
4. 一旦吸入电极被充分抛光，在电极侧面形成一个距离电极底部约1厘米的孔，以便放置银线。这是通过使用金刚石涂层台阶的“细”侧来初始化一个小孔来实现的。一旦创建，吸引电极更锐利地倾斜，并继续打分玻璃。这将产生一个小的渐变，这将有助于阻止刺激所需的银丝的弯曲（图2）
  
  图2.最终吸引电极的代表性图像。箭头表示打击孔的位置和阻止刺激CM9 MN所需的银线弯曲所需的梯度。
为飞行准备实验：
1. 使用巴斯德吸管从食物小瓶中取出一只处女雌蝇（见附注）。
2. 将飞行物放在冰上，直至姿势控制失效〜15/20秒
3. 快速将飞行物转移到一个小的Sylgard解剖表面，并使用30 G针头打死头部（图3，右图）。
4. 将头背放在解剖面上，将长鼻针插入延伸位置（图3左图）。
5. 在成功打浆（图3左图）后，在冷HL3记录解决方案中覆盖整个头部（见配方）。
  
  图3.代表性图像，显示飞前（右）和断头后（左）。虚线表示在飞行中切割成功地斩首头。左侧的图像显示如何在剖开角质层之前正确地排出头部黑色框表示要移除的角质层的区域，以暴露CM9组肌肉。
6. 使用尖锐的钨针将准备好的包含天线的头部头皮角质层解剖，以穿透面板下方的软角质层和Vannas弹簧剪刀切割角质层。然后使用5CO细镊子去除可能在移除面板后残留的任何剩余气管气囊。在这里使用5CO镊子去除剩余的空气袋可减少损伤神经/肌肉的风险（图3，左图和图4B-黑盒）。
7. 将长鼻针重新插入收缩位置，以增加CM9肌肉的张力（图4B和4C）（见注）。 CM9组肌肉从位于头腔内的长鼻肌肉结束处发现的棕色/橙色结构识别，在头部两侧的眼睛底部。图4D显示肌肉的半透明度，与残留在头腔内解剖后的更不透明的脂肪体相比较，可以很容易地识别。
  
  图4. CM9准备。 A.表示CM9肌肉和运动神经元的大致位置的果蝇的图。 B.解剖的飞头的代表性图像，指示在记录期间在肌肉上产生足够张力所需的昆虫针的最终定位。 C. CM9肌肉和MN的放大图像（D）解剖CM9与*表示用于记录的大多数颅肌纤维的位置。
8. 将解剖盘移至显微镜架上的支架上（图5.4）。一旦就位，将接地线（图5.5）和刺激接地线（图5.7）放入HL3浴中，以确保形成完整的电路。
9. 使用10x物镜（图5.3），将吸电极（图5.6）缓慢降低到HL3浴中，并继续电极的运动，直到其进入准备平面。通常，只要注意降低电极时，可以将机械手设置保持为1.
  
  图5.钻机设置概述。 1。记录电极头阶段; 2.录音。电极座3.10x / 40x目标;显微镜滑块架;接地线吸电极线/支架; 7.刺激器接地线。
10. 一旦定位，将CM9MN（图4C-咽神经）的环吸入抛光的吸引电极中，并用修改的HL3填充以产生通过结构（图6A）。有时，为了吸收CM9神经，有必要改用40倍的目标，因为在10x目标下并不总是很容易观察到。
  注意：有两个神经支配着CM9组的肌肉，但是对于第二个较小的神经支配以及如何参与CM9功能却知之甚少。我们知道，由于在突触前神经末梢缺乏阳性vGLUT染色，第二次神经支配不是谷氨酸能输出。必须注意，只能吸收CM9 MN，而不是较小的神经支配，因为这将阻碍成功的肌肉刺激。
  
  图6. CM9 NMJ的代表性mEPSP和EPSP迹线。：一种。录音安排; B.由7天龄的动物产生的EPSP和mEPSP的代表性痕迹。
来自CM9肌肉的细胞内记录
1. 在ROE-200显微操作器上使用粗略运动（设置3/4）将记录电极缓慢降低为HL3（图5.1）。使用10x物镜，找到记录电极的尖端，并小心，直到电极处于制备平面。
2. 一旦电极处于CM9组肌肉细胞运动的平面，就可以避免刺激肌肉和破坏电极（设置在ROE-200显微操作器上的6/7）。在这一点上，目标也应该改为40倍，确保避免击中已经就位的电极。
3. 确定肌肉记录，一般是从前位置可以获得的最颅骨CM9肌肉纤维，并将记录电极小心地刺入肌肉（图4D）。
刺激CM9 MN
1. 在0.5-5 V下刺激CM9 300微秒。通过遵守EPSP外观的不同电压阈值来确认遵守基于突触前的动作电位（图6B）。
2. 一般来说，7-35天的动物对42天龄的动物的EPSPs幅度为〜9mV（±0.36）和〜12mv（±0.55）。 mEPSP幅度在整个飞行寿命期间保持相对恒定（约1.13mV [±0.43]）（参见Mahoney等人，2014年为7-60天龄的女性女性的完整值）。 />

数据分析

1600型的Neuroprobe放大器与PowerLab 4/30结合使用，用于放大和数字化数据。
LabChart 7用于以1 Hz的速率记录数据，每次飞行60秒，请注意在每60秒火车终点后记录输入电阻。
MiniAnalysis用于分析mEPSP和EPSPs的幅度（图6B）。从MiniAnalysis中，EPSP和mEPSP幅度的值在GraphPad Prism 6中列出，从中进行适当的统计分析以评估显着性。通常，使用具有Bonferroni校正的单因素方差分析进行所有多重比较以进行多次比较。所有的双向比较都是使用标准学生的测试进行的。

笔记

养殖业：维珍女性维持在25°C，每隔一天翻转一次，直到需要进行记录。建议实验中使用的苍蝇不会在人口稠密的环境中生长（通常每瓶约10-20个女性）。
肌肉紧张：为了确保成功录音，必须在CM9肌肉组上施加足够的张力。这可以通过轻轻推动长鼻，通过将解剖的针刺入的长鼻子向后推向大脑并将针朝向眼睛的基部扫过来实现。根据哪一组CM9肌肉记录，这将决定哪一侧长鼻子重新定位。
电极参数：Heat-611，Pull-70，Vel-60，Del-130。
与本协议中使用的那些类似的尖锐记录电极主要用于测量通过的电流或跨越神经元/细胞膜的电压。这些电极与传统的全细胞贴片移液管不同，因为尖端需要足够锐利以穿透细胞膜。另一方面，吸引电极的功能是在轴突周围产生密封，以便当动作电位传播时检测在轴突周围流动的局部电路电流，然后可以通过使用记录电极。根据是否使用电流钳位或电压钳模式，这将决定是否遵守EPSP（电流钳）或EPSC（终板突触后电流电压钳位）。

食谱

修饰的血淋巴样溶液（HL3.1）

注意：250毫升所需的剩余体积由ddH 2 O组成。添加了CaCl 2 和MgCl 2 在记录之前至10毫升HL3。使用前请将pH调至7.31。

参考

Brown AL，Johnson，BE，Goodman，MB（2008）。＆nbsp; 使用可编程拉杆制作贴片移液器和锋利电极。（20）：e939。

Gordon，MD和Scott，K.（2009）。电动机控制在果蝇味道电路。神经元 61（3）：373-384。

Kimura，KI，Shimozawa，T.and Tanimura，T。（1986）。分离具有异常长鼻反射的果蝇突变体。 J Exp Zool 239（3）：393-399。

Mahoney，R.E.，Azpurua，J.and Eaton，B.A。（2016）。胰岛素信号通过4eBP-依赖性的细胞增殖机制的修改。 5.

Mahoney，RE，Rawson，JM和Eaton，BA（2014）。＆nbsp; 突触内稳态设定点的年龄依赖性变化。 Neuros ci 34（6）：2111-2119。

Rawson，JM，Kreko，T.，Davison，H.，Mahoney，R.，Bokov，A.，Chang，L.，Gelfond，J.，Macleod，GT and Eaton，BA（2012）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22268717”target =“_ blank”>饮食对dynactin复合突变体突触小泡释放的影响：改善活力的机制在运动疾病期间。老年细胞 11（3）：418-427。