材料和试剂

6孔组织培养板（TPP Techno Plastic Products，目录号：92006）
10厘米微生物学培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1473.001）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
70μm细胞过滤器（Greiner Bio One International，目录号：542070）
40μm细胞过滤器（Greiner Bio One International，目录号：542040）
顶级过滤器（TPP Techno Plastic Products，目录号：99505）
5ml血清移液管（Corning，Falcon ®，目录号：357543）
10ml血清移液管（Corning，Falcon ®，目录号：357551）
25 ml血清移液管（康宁，Falcon ®，目录号：357525）
移液瓶头10μl（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1180-3810）
移液瓶提示20μl（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1120-1810）
移液瓶提示200μl（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1120-8810）
移液瓶提示1000μl（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1126-7810）
胶原酶IV（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17104019）
Knockout-Dulbecco的改良Eagle培养基（KO-DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10829018）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
1-Thiogylcerol（Sigma-Aldrich，目录号：M1753）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4403）
牛血清白蛋白（BSA）低内毒素（PAA，目录号：K31-011）
1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190094）
人类骨形态发生蛋白4（BMP4）研究级（Miltenyi Biotec，目录号：130-110-921）
重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（PeproTech，目录号：100-18B）
重组人FLT3L（PeproTech，目录号：300-19）
重组人GM-CSF（PeproTech，目录号：300-03）
重组人类胰岛素样生长因子1（IGF1）（PeproTech，目录号：100-11）
人白细胞介素3（IL-3）研究级（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-193）
人IL-4研究级（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-373）
人类SCF研究级（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-693）
人血小板生成素（TPO）研究级（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-013）
重组人血管内皮生长因子（VEGF）（PeproTech，目录号：100-20）
1x StemPro-34 SFM（Thermo Fisher Scientific，目录号：10639011）
青霉素 - 链霉素10,000U / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
超细胞白介素6（IL-6）（由S.Rose John，德国基尔，阿尔布雷希奇大学医学院生物化学研究所提供，[Fischer等人，1997] ，另见备注）
α-最小必需培养基（α-MEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12571063）
β-巯基乙醇（50mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31350010）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10500064）
罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11875093）
胶原酶IV溶液（1mg / ml）（参见食谱）
0.1％明胶溶液（见配方）
1-硫代甘油储备溶液（100mM）（参见食谱）
L-抗坏血酸储备溶液（50mg / ml）（参见食谱）
0.1％BSA溶液（见配方）
BMP4储备溶液（25μg/ ml）（参见食谱）
bFGF储备溶液（100μg/ ml）（参见食谱）
FLT3L储备溶液（25μg/ ml）（见配方）
GM-CSF储备溶液（100μg/ ml）（见配方）
IGF1储备溶液（40μg/ ml）（参见食谱）
IL-3储备溶液（150μg/ ml）（参见食谱）
IL-4储备溶液（20μg/ ml）（参见食谱）
SCF储备液（100μg/ ml）（见食谱）
TPO储备溶液（20μg/ ml）（参见食谱）
VEGF储备溶液（100μg/ ml）（参见食谱）
造血祖细胞基础分化培养基（见配方）
感应介质d0（见配方）
感应介质d1（见配方）
感应介质d2（参见食谱）
感应介质d4（见配方）
感应介质d6（参见食谱）
OP9培养基（参见食谱）
DC分化基础培养基（见食谱）
DC分化FSG4培养基（参见食谱）
DC分化FSG培养基（参见食谱）

设备

1,000μl移液器（Gilson，目录号：F123602）
200μl移液器（Gilson，目录号：F123601）
20μl移液器（Gilson，目录号：F123600）
10μl移液器（Gilson，目录号：F144802）
Pipetboy（INTEGRA Biosciences，目录号：155000）
水浴（JULABO，型号：SW22）
倒置光学显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM IL LED）
高压灭菌器
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Multifuge 3 L）
流动罩（Heraeus）
具有氮供应和O 2传感器的自动CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus sup> 240i，目录号：51026331）
真空泵（INTEGRA Biosciences，目录号：158300）
标准冰箱
标准非除霜冷冻机

程序

iPS细胞（或ES细胞）分化成造血祖细胞总结在图1中

图1. iPS细胞（或ES细胞）分化为造血祖细胞的分化方案的示意图。显示分化时间和相应的分化步骤和细胞因子组成（彩色盒子）。
1. 为了将iPS细胞（或ES细胞）分化成造血祖细胞，在开始实验之前，预热所需量的胶原酶IV溶液（1mg / ml，37℃，参见食谱）和KO-DMEM（室温，RT）。准备诱导培养基d0（参见食谱）并在室温下预热。
2. 收获iPS细胞（或ES细胞）达到70-80％汇合时。因此，吸出培养基并将胶原酶IV溶液加入细胞。体积取决于所用的培养皿。确保使用胶原酶IV溶液（例如，每孔1ml，6孔板，每10cm皿4ml）完全覆盖细胞。
3. 在含有5％CO 2的正常培养箱中，在37℃下将细胞与胶原酶IV孵育40-60分钟。检查菌落边缘是否开始卷起。只有当菌落边缘从所有部位卷起，并且菌落才松散地粘附在板上，继续步骤A4。如有必要，孵育10-15分钟，但不要超过80分钟的胶原酶IV治疗，因为这会影响细胞活力。
4. 用KO-DMEM稀释胶原酶IV，比例为1/3，意味着每ml胶原酶IV溶液加入2 ml KO-DMEM。使用10毫升移液管清洗菌落，重新悬浮并收集在50ml Falcon管中。
5. 如果将iPS细胞（或ES细胞）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上培养，则在室温下通过重力将独立的iPS细胞（或ES细胞）簇和单个MEF通过重力培养10分钟。大的iPS细胞（或ES细胞）簇将沉降到底部，而单个MEF将保持悬浮状态。吸出80％的上清液去除MEF。如果将iPS细胞（或ES细胞）培养为无饲养细胞，则直接继续步骤A6。
6. 通过在212×g下离心4分钟收集iPS细胞（或ES细胞）簇。如果没有另外说明，所有的离心步骤都是在RT进行的。吸出上清并将沉淀重悬于1ml诱导培养基d0中。用1毫升移液管上下移动以分裂群集。群集应包含50-100个细胞（图2）。因此，将一滴细胞悬浮液转移到微生物学级培养皿上，并通过显微镜检查簇大小。
  
  图2.从iPS细胞到造血祖细胞。在分化成造血祖细胞期间，iPS细胞的代表性的对比图像。未分化的iPS细胞集落在第0天，小EB和一些细胞碎片在第2和6天。比例尺=500μm。血液内皮斑块和造血祖细胞在第8,10和14天。比例尺=200μm。
7. 如果聚类尺寸合适，请将细胞悬浮液通过70μm的细胞过滤器，以除去剩余的较大簇。用感应培养基d0填充到最终体积，并转移到微生物学级培养皿中以形成胚状体（EB）。我们通常使用10 ml的诱导培养基d0作为两个具有iPS细胞（或ES细胞）的6孔板
8. 将细胞置于37℃，5％CO 2培养箱中，将自动培养箱的O 2调节物置于5％。因此，O 2级别将缓慢降低至5％。
9. 在分化的第1天（EB形成后24小时），许多细胞（约40-50％）将死亡。准备感应介质d1（参见食谱）并在室温预热。用新鲜培养基（感应培养基d1）以1/2的比例稀释老培养基（诱导培养基d0）。根据总体积（老培养基+新鲜培养基）计算诱导培养基中bFGF的体积。
  实施例：10ml诱导培养基d0 + 5ml含有1.5μlbFGF和1.6μlBMP4的诱导培养基d1培养基。最终的bFGF浓度应为10ng / ml。继续在缺氧条件下培养（5％O 2 ，5％CO 2
10. 在分化的第2天，会有很多细胞碎片可见（图2）。收集EB在50ml Falcon管中。尽管使用微生物学级培养皿，但有些EB松散地贴在菜上。用1x PBS（预热至RT）将松散粘附的EB漂洗两次，并加入EB悬浮液中。离心EB在136 x g处理4分钟。吸入上清液，在诱导培养基d2（预热至RT，参见食谱）中轻轻重悬沉淀（如果需要使用1ml移液管分解聚集的EB）并转移到新的微生物学培养皿中。使用与第0天相同的音量（参见步骤A7）。继续在缺氧条件下培养（5％O 2，5％CO 2）。
11. 在分化的第4天，如步骤A10那样进行。最后，将EB置于诱导培养基d4（预热至RT，参见食谱）中并转移到新的微生物学培养皿中。使用与第0天相同的音量（参见步骤A7）。继续在缺氧条件下培养（5％O 2，5％CO 2）。
12. 在分化的第6天，如步骤A10那样进行。最后，将EB重新悬浮在诱导培养基d6（预热至RT，参见食谱）中并转移至涂有0.1％明胶的组织培养塑料（TCP）培养皿（参见食谱）。使用与第0天相同的音量（参见步骤A7）。继续在缺氧条件下培养（5％O 2，5％CO 2）。
13. 在分化的第8天，大多数EB在TCP上是粘附的。收集介质并以136 x g离心4分钟。将吸出的上清液重新悬浮于诱导培养基d6（预热至RT）中，并小心地转移到TCP培养皿中。使用与第0天相同的音量（参见步骤A7）。从现在开始，避免将EB从菜中分离出来。将细胞转移至37℃，5％CO 2和常氧培养箱。
14. 在分化的第10天和第12天，如步骤A13那样进行中等变化。
15. 根据iPS细胞（或ES细胞）克隆，使用的造血祖细胞将分别从第6-14天（iPS细胞）或第21-28天（ES细胞）分化的贴壁或松散粘附的EB发芽（图2 ，视频1）。 iPS细胞（或ES细胞）衍生的造血祖细胞是CD43 +（图3），并用于第10-14天（iPS细胞）和第24-28天（ES细胞）之间的DC分化。 />
  视频1
  
  图3. iPS细胞通过血液内皮发育成造血祖细胞。在分化的第6和10天有代表性的流式细胞术数据。上行显示CD34 + CD31 + 血液内皮细胞群体的门控。中央排显示CD43 + CD31 + 造血祖细胞的门控。下图显示成熟CD43 + CD45 + 造血祖细胞的门控。
将iPS细胞（或ES细胞）衍生的造血祖细胞分化为DC亚型，如图4所示。

图4.将iPS细胞（或ES细胞）衍生的造血祖细胞分化为DC亚型的分化方案 CD43 + 造血祖细胞在OP9基质细胞上与FSG4和FSG共培养细胞因子分别产生cDC1和cDC2（FSG4），或cDC1和pDC（FSG）。
1. 为了将iPS细胞（或ES细胞）衍生的造血祖细胞分化为DC，将种子照射的OP9基质细胞（30Gy）以1.2×10 4个细胞/孔重悬浮于OP9培养基（参见食谱）在DC分化前一天，在0.1％明胶包被的TCP培养皿上。我们更喜欢使用6孔板，因为在DC分化过程中，我们可以使用相同的细胞进行不同的处理和实验。
2. 通过轻轻移液从步骤A15收集造血祖细胞，并将细胞悬液通过40μm细胞过滤器，以除去剩余的EB。用1x PBS（预热至RT）洗涤板两次，并将该悬浮液通过相同的细胞过滤器。
3. 离心机以416×g流通4分钟。吸出上清液，并在规定体积的1x PBS（预热至RT，例如5ml）中洗涤沉淀。使用Neubauer室计数细胞（例如，，并将台盼蓝作为活/死细胞标记）。
4. 离心细胞悬浮液在416×g下静置4分钟。吸出上清液并将细胞重悬于DC分化基础培养基（预热至RT，参见Recipes）中，密度为1×10 6细胞/ ml〜1.5×10 6细胞/ ml。分别在两个独立的Falcon管中分离细胞悬浮液，分别标记为FSG4和FSG。
5. 在一个Falcon管（FSG4）中加入100ng / ml FLT3L，20ng / ml SCF，20ng / ml GM-CSF和20ng / ml IL-4终浓度。在其他Falcon管（FSG）中加入100ng / ml FLT3L，20ng / ml SCF和10ng / ml GM-CSF终浓度。
6. 从OP9基质细胞吸出OP9培养基，并将FSG4和FSG细胞悬浮液分散到OP9基质细胞上。例如，可以将6ml的FSG4和FSG悬浮液分别分布在6孔板（2ml /孔）的3个孔中。
7. 培养细胞在37℃和5％CO 2
8. 每隔一天进行一次介质更换。准备新鲜培养基：如步骤B4中所取的基础DC分化培养基体积的一半，但加入细胞因子的量的两倍。小心地倾斜板，慢慢吸出上清液。细胞松散地粘附到饲养层上，如果缓慢移除培养基，那些悬浮液将会沉降到底部。避免干扰细胞例如，通过将其从供料层上冲洗掉。删除约50％的旧培养基（例如，，每6孔1ml）。加入50％新鲜制备的培养基（见上文，预热至RT）。因此，总体积中的细胞因子浓度将与步骤B5中给出的相同。＆nbsp;
9. DC通过DC分化天（dd）4（图5）获得了DC形态，可用于dd4-dd7之间的分析。要收集DC，请小心地将其从饲料层中冲洗干净。用1x PBS（预热至RT）洗涤板两次。避免分离OP9基质细胞。在冰上将细胞收集在50ml Falcon管中，分别进行必要的分析和实验
  
  图5. iPS衍生的DC在分化期间获得DC形态。在分化期间照射的OP9基质细胞（白色箭头）上的iPS细胞衍生的DC（黄色箭头）的代表性的对比图像。刻度棒=25μm。

数据分析

iPS细胞（或ES细胞）衍生的DC亚群可以如我们最近的出版物（Sontag等人，2017）所述进行分析。

笔记

而不是超IL-6，我们还测试了终浓度为100ng / ml的重组人IL-6（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-352），并获得了类似的结果。

食谱

胶原酶IV溶液（1mg / ml）
1,000毫克胶原酶IV
1000 ml KO-DMEM
注意：无菌过滤器带有0.2μm顶部瓶子过滤器。等分试样（如50ml）并储存于-20℃。
0.1％明胶溶液
0.5克明胶
500毫升蒸馏水
注意：在121°C高压灭菌30分钟。明胶会在高压灭菌过程中溶解。在室内存放对于涂层，用明胶溶液覆盖组织培养皿的表面，并在37℃下孵育至少15分钟。吸出明胶溶液前电镀细胞。立即使用，无需额外洗涤或干燥。
1-硫代甘油储备液（100mM）
87μl1-硫甘油
10毫升蒸馏水和无菌水注意：1-硫代甘油具有高粘度。缓慢移液以准确分配1-硫代甘油。等分试样（如1毫升）并储存于-20℃。
L-抗坏血酸储备溶液（50 mg / ml）
100毫克L-抗坏血酸
2 ml蒸馏水和无菌水注意：等分试样（如250μl）并保存在-20°C。防光。
0.1％BSA溶液
0.1克BSA
100 ml 1x PBS
注意：请于4°C储存。
BMP4储备溶液（25μg/ ml）
10μgBMP4
400μl0.1％BSA溶液
bFGF储备液（100μg/ ml）
50μgbFGF
500μl0.1％BSA溶液
FLT3L储备溶液（25μg/ ml）
100μgFLT3L
4 ml 0.1％BSA溶液
GM-CSF储备溶液（100μg/ ml）
20μgGM-CSF
200μl0.1％BSA溶液
IGF1储备溶液（40μg/ ml）
100μgIGF1
2.5 ml 0.1％BSA溶液
IL-3储备溶液（150μg/ ml）
25μgIL-3
167μl0.1％BSA溶液
IL-4储备溶液（20μg/ ml）
10μgIL-4
500μl0.1％BSA溶液
SCF储备溶液（100μg/ ml）
10μgSCF
100μl0.1％BSA溶液
TPO储备溶液（20μg/ ml）
100μgTPO
5 ml 0.1％BSA溶液
VEGF储备溶液（100μg/ ml）
10μgVEGF
100μl0.1％BSA溶液

注意：所有细胞因子（BMP4，bFGF，FLT3L，GM-CSF，IGF1，IL-3，IL-4，SCF，TPO和VEGF）以等分试样储存（例如，10-50μl） C在标准的非除霜冷冻室。解冻后，我们将其保存在4°C，并使用它们四周。
造血祖细胞基础分化培养基
237 ml 1x StemPro-34 SFM
6.5 ml StemPro-34补充剂（附带1个StemPro-34 SFM）
2.5 ml青霉素 - 链霉素（终浓度100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）
2.5ml L-谷氨酰胺（终浓度2mM）
1.0ml 1-硫代甘油储备溶液（终浓度0.4mM）
250μlL-抗坏血酸储备溶液（终浓度50μg/ ml）
感应介质d0
20毫升造血祖细胞基础分化培养基
6.7μlBMP4储备液（终浓度8 ng / ml）
感应介质d1
20毫升造血祖细胞基础分化培养基
6.7μlBMP4储备液（终浓度8 ng / ml）
4.0μlbFGF储备溶液（终浓度10ng / ml，参见方法步骤A9）
感应介质d2
20毫升造血祖细胞基础分化培养基
6.7μlBMP4储备液（终浓度8 ng / ml）
2.0μlbFGF储备液（终浓度10ng / ml）
2.0μlVEGF储备溶液（终浓度10ng / ml）
20μl超IL-6（终浓度10 ng / ml）
12.5μlIGF1储备溶液（终浓度25ng / ml）
20μlSCF储备溶液（终浓度100 ng / ml）
感应介质d4
20毫升造血祖细胞基础分化培养基
2.0μlbFGF储备液（终浓度10ng / ml）
2.0μlVEGF储备溶液（终浓度10ng / ml）
20μl超IL-6（终浓度10 ng / ml）
12.5μlIGF1储备溶液（终浓度25ng / ml）
20μlSCF储备溶液（终浓度100 ng / ml）
8.0μlFLT3L储备溶液（终浓度10 ng / ml）
20μlTPO储备溶液（终浓度20ng / ml）
4.0μlIL-3储备溶液（终浓度30 ng / ml）
感应介质d6
20毫升造血祖细胞基础分化培养基
20μlSCF储备溶液（终浓度100 ng / ml）
8.0μlFLT3L储备溶液（终浓度10 ng / ml）
20μlTPO储备溶液（终浓度20ng / ml）
4.0μlIL-3储备溶液（终浓度30 ng / ml）
OP9培养基
195mlα-MEM
50ml FBS（终浓度20％）
2.5 ml青霉素 - 链霉素（终浓度100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）
2.5ml L-谷氨酰胺（终浓度2mM）
DC分化基础培养基
220ml RPMI 1640
25毫升FBS（终浓度10％）
2.5 ml青霉素 - 链霉素（终浓度100 U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）
2.5ml L-谷氨酰胺（终浓度2mM）
500μlβ-巯基乙醇（终浓度0.1mM）
DC分化FSG4培养基
20 ml DC分化基础培养基 80μlFLT3L储备液浓度（终浓度100ng / ml）
40μlSCF原料浓度（终浓度20ng / ml）
4.0μlGM-CSF储备溶液（终浓度20ng / ml）
20μlIL-4储备液浓度（终浓度20 ng / ml）
DC分化FSG培养基
20 ml DC分化基础培养基 80μlFLT3L储备液浓度（终浓度100ng / ml）
40μlSCF原料浓度（终浓度20ng / ml）
2.0μlGM-CSF储备溶液（终浓度20ng / ml）