材料和试剂

移液针头（Corning，supo）®/ sup> Isotip ®过滤0.2-10μl）（Corning，目录号：4807）
移液头（Axygen ® TF200RS1-200μl）（Corning，Axygen ，目录号：TF-200-R-S）
移液器吸头（Axygen ® TF1000RS100-1,000μl）（Corning，Axygen ，目录号：TF-1000-R-S）
1.5ml微量离心管（RNase，DNase和无热原）（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
0.2ml薄壁PCR管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3412）
Falcon TM 将50ml圆锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
T-75烧瓶（Corning，目录号：3290）
24孔细胞培养板（Corning，目录号：3527）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：442404）
HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
HepG2细胞（ATCC，目录号：HB-8065）
pGL3对照载体（Promega，目录号：E1741）
单击® TOP10化学能力 E。大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C404010）
嵌合人β-珠蛋白内含子序列（Gene synthesis，GeneArt，Applied Biosystems）：5'-CAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGACGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGG-3'
SV40增强子序列：5'-CGATGGAGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTA GGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGC-3’
用于嵌合内含子扩增的寡核苷酸引物（综合DNA技术合成，25nmol，去保护脱盐）：
内含子-Fw：5'-ATCTATCGGGATCCAAGCTTCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGG-3'
内含子-Rv：5'-CATTATCTGGATCCCCATGGACCCTGTGGAGAGAAAGGCAA-3'
循环序列（综合DNA技术合成，25nmol，脱保护脱盐）：
环-1：5'-pGATCTGACCAGTTTTCTGGTCA-3'
环2：5'-pTCGACAGGCTCTTTTGAGCCTG-3'
聚（A）信号的寡核苷酸引物（由Integrated DNA Technologies合成，25nmol级，去保护脱盐）：
polyA-Fw：5'-TGTAATTCTAGAGTCGGGGCG-3'
polyA-Rv：5'-ATCTATCGGGATCCTTACCACATTTGTAGAGGTT-3'
FastDigest III（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：FD0504）
FastDigest I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：FD0573）
FastDigest Bam（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：FD0054）
FastDigest II（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：FD0083）
FastDigest Xho I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：FD0694）
FastDigest I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：FD0644）
FastDigest I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：FD0914）

UltraPure TM无DNA酶/无RNA酶的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）

T7 DNA聚合酶（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EP0081）

DNA聚合酶，重组体（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EP0402）

10x FD缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：B64）

T4 DNA连接酶（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EL0014）

dNTP设置100mM溶液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0181）

QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）

醋酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P1190-100G）

琼脂糖，LE，分析纯（Promega，目录号：V3125）

乙醇，绝对（Fisher Scientific，目录号：BP28184）

氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888-500G）

六氯化镁（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-100G）

Tris-HCl（Roche Diagnostics，目录号：10812846001）

乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）

腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A2383-1G）

溴化乙锭溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610433）

苯酚溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4557-100ML）

氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：288306-1L）

3-甲基-1-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：309435-100ML）

GeneRuler DNA梯形混合物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：SM0331）

HyClone Dulbecco的改良Eagles中/高葡萄糖与L-谷氨酰胺，丙酮酸钠（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30243.01）

HyClone标准胎牛血清（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30088.03）

青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）

转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）

Opti-MEM ® I还原血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985070）

荧光素酶测定系统（Promega，目录号：E1501）

液氮

TE缓冲（见配方）

设备

移液器（Gilson，PIPETMAN Classic ，P2，P20N，P200N和P1000N）

CO 2培养箱（Thermo Electron）

振荡器（Heidolph Instruments，型号：Unimax 2010）

玻璃烧杯（Schott，Duran）

标准热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：GeneAmp PCR System 9700）
注意：本产品已停产。

Gel doc（Bio-Rad Laboratories，Gel Doc Imager）

凝胶运行装置（Amersham Biosciences）

凝胶染色托盘（GE Healthcare）

台式离心机（Eppendorf，型号：5430 R）

热块（Thermomixer舒适）（Eppendorf）

分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000）

微波（松下）

II级生物安全柜（Gelman）

Synergy H1多模式阅读器（BioTek Instruments，型号：Synergy H1）

软件

GraphPad Prism软件5.0

程序

荧光素酶表达质粒变体的设计和分子克隆
为了研究合成内含子和/或SV40增强子对哑铃驱动基因表达的功能，我们基于pGL3对照载体克隆相应的质粒载体。 pGL3对照载体在SV40启动子的控制下携带萤火虫荧光素酶基因以及表达盒的3'末端的SV40增强子元件。克隆如下所述进行：

通过基因合成（GeneArt，Applied Biosystems）合成137bp嵌合人β-珠蛋白微内含子，使用引物内含子-Fw和内含子-Rv进行PCR扩增，然后使用HindIII插入到pGL3-对照质粒III和Nco I位点以创建内含子和SV40增强子（int-luc-enh）（Jiang等人）特有的荧光素酶表达载体，2016和2017）。生产过程的说明如图1所示

图1.质粒克隆方案的图示。步骤1：质粒p-int-luc-enh是通过将b-珠蛋白微型内含子插入到HindⅢ和NcoI区的载体pGL3-Control（p-luc-enh）。步骤2：通过SV40增强子与载体pGL3-Control（p-luc-enh）的SV40聚（A）位点通过SV40 polyA位点使用Xba 进行交换，可以产生质粒p-luc我和 Bam HI。步骤3：通过用SV40 polyA位点将SV40增强子与载体p-int-luc-enh的SV40 polyA位点交换，使用Xba I和Bam HI。

pGL3对照中的SV40增强子序列通过用XbaI和BamHI HI消化载体而被删除。通过这样做，我们也删除了SV40晚期聚（A）信号。为了检索SV40聚（A）信号，使用引入了Xba I和Bam HI位点的引物polyA-Fw和polyA-Rv对其序列进行PCR扩增。用XbaI和Bam HI切割PCR产物，并重新插入SV40 poly（A）信号以产生缺少内含子和SV40增强子的质粒（luc）（Jiang等人，2016和2017）。生产过程的说明如图1所示

从含有内含子和SV40增强子的pGL3对照变体开始重复步骤A2中描述的等同过程，以产生仅具有内含子（int-luc）（Jiang等人）的质粒>，2016）。生产过程的说明如图1所示

为了简化，将新名称分配给表1所列的结构。

表1.荧光素酶表达构建体的命名。质粒被分配前缀'p'，哑铃前缀'db'。

生产荧光素酶表达的哑铃载体

使用由核酸酶（ELAN）循环连接法（Cost，2007）辅助的酶连接，由方法A所述的相应质粒产生荧光素酶表达的哑铃载体。简而言之，从相应的亲本质粒直接切出基因表达盒。然后将按“费用”方案设计的5'磷酸化环形成寡核苷酸结合形成哑铃形结构。生产过程的说明如图2所示

图2.使用ELAN循环连接方法的哑铃向量生产过程的图示。在该策略中，首先用识别位点的两个限制性内切核酸酶（本例中为BamHI和Xho I）消化含有转基因表达盒的亲本质粒侧翼转录单位。接下来，在四种限制性内切酶BglII，BamHI，HindⅢ和BamHI的存在下连接形成具有相容限制突出端的环结构的5'磷酸化寡核苷酸（ODN） Xho I和Sal I，其切割由环ODN或转录单元形成的同源二聚体。该策略有助于生成正确连接的哑铃矢量。随后通过T7 DNA聚合酶处理破坏非连接序列，其显示出强的3'-5'核酸外切酶活性（Engler和Richardson，1983）。 RE，限制酶

对于ELAN连接反应，在线性表达单元DNA上以50倍摩尔过量加入环ODN。由循环或转录单元形成的二聚体等错配的副产物被一组四种限制性内切酶切割（BamHI，BglII，Xho， / em> I， Sal I）以促进哑铃形成。加入第五限制性内切酶（Ise I）以切割通过连接ODN与质粒骨架形成的哑铃。该第五种酶可以是相对于克隆载体骨架的单个或理想的多切割机，但不能在哑铃载体内切割。通过外切核酸酶处理除去未连接的序列。反应的详细设置总结在表2中。

表2.使用ELAN循环连接策略产生荧光素酶表达哑铃的三步反应程序。步骤1：从相应的亲本质粒切除表达盒，在该实施例中使用酶Xho I和Bam HI。步骤2：包括T4DNA连接酶和5个限制性内切核酸酶的ELAN反应，在该实施例中，Bgl II，SalI，Bam HI， > Xho I和 Ase I。步骤3：使用T7 DNA聚合酶进行核酸外切酶反应。建议再次添加步骤2的限制性内切核酸酶，以确保从步骤2接管的任何哑铃形副产物被切割并使其可修饰以用于外切核酸酶降解。在步骤1和2之后，酶被热灭活，但不需要进一步纯化。

通过琼脂糖凝胶电泳分析哑铃载体的数量和质量，如图3所示。在转染细胞之前，使用制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化哑铃DNA，然后乙醇沉淀。对于乙醇沉淀，将50μl的洗脱体积用蒸馏水加满至400μl。然后加入40μl3M乙酸钾（pH5.0）和2.5体积（1100μl）无水乙醇，通过倒置管将该溶液混合并置于-20℃沉淀20分钟。通过以16,100×g离心15分钟将载体DNA沉淀。颗粒用500μl4℃70％乙醇洗涤并风干。纯化的DNA然后溶于TE缓冲液或蒸馏水中

图3.用于增强基因表达的哑铃载体。左侧。高级哑铃载体设计：db-luc：基本载体; db-luc-enh：具有SV40增强子功能的哑铃; db-int-luc：哑铃特色的内含子; db-int-luc-enh：具有SV40增强子和内含子的哑铃。右边。核酸外切酶处理后四种荧光素酶dbs的0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。检测到预期的哑铃带，但没有副产物。右边的车道数量对应于左边的哑铃号码。 M：GeneRuler DNA梯形混合物（Thermo Fisher Scientific）。

用荧光素酶表达质粒和哑铃转染人组织培养细胞

将HEK293T和HepG2细胞在补充有10％（v / v）热灭活的胎牛血清（Hyclone）和1％青霉素 - 链霉素溶液（Invitrogen）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Invitrogen）中培养。将细胞保持在5％CO 2的湿润培养箱中，并以80-90％汇合流通。

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）按照制造商的方案转染细胞。简言之，在转染前一天将细胞接种在24孔板中，以70-80％汇合。在转染当天，将400ng DNA与Opti-MEM（Invitrogen）中的1μlLipofectamine 2000混合，总体积为100μl。在20分钟孵育时间内，室温下形成DNA-脂质体复合物，然后将混合物滴加到细胞中。

收获转染的细胞并在转染后48小时进行分析

萤光素酶测定
使用Promega的荧光素酶测定系统测量细胞裂解物中萤火虫荧光素酶的活性：

对于细胞裂解，去除组织培养基，并向每个24孔加入100μl被动裂解缓冲液（PLB，由制造商提供）。细胞在室温下温和摇匀20分钟

裂解程序后，将细胞裂解物等分，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃。虽然供应商没有进一步规定，但冻结样品稳定了数月或数年。

对于荧光素酶测定，将10μl每个样品转移到不透明的白色96孔板（Nunc）中。

Synergy H1混合多模式微孔板读数器（BioTek）系统用于自动注入萤光素酶测定试剂（LARII）并读取发光。背景信号由每个测定的空白和水对照确定，荧光素酶活性根据Promega（Schagat等人，2007）的推荐标准化。

代表性数据如图4所示

图4.通过β-珠蛋白基因嵌合内含子和/或全长SV40增强子增强哑铃与质粒驱动的荧光素酶表达 5×10 4 HEK293T或用400ng哑铃载体或等量的亲本质粒转染接种在24孔中的HepG2细胞。在转染后48小时测量由等量量的哑铃载体和质粒触发的荧光素酶表达。误差条表示从三到五个独立实验的平均值的平均偏差。 Re：相对

数据分析

Prism 5.0 GraphPad软件用于数据呈现和统计分析。荧光素酶测定结果显示为平均值±SEM。为了比较数据，使用单因素ANOVA与Newman-Keuls事后检验。 *表示P 值< 0.05，**表示P 值< 0.01，***表示P 值< 0.001。

笔记

1 FD单位由Thermo Fisher Scientific定义为1μlFastDigest酶。

根据我们的经验，连接反应在4小时内完成，较长的孵育时间不能提高哑铃产量。

我选择破坏细菌pGL3-Control质粒骨架，因为它不包含目标基因，SV40增强子和内含子的哑铃载体序列内切割。然而，该酶的选择取决于哑铃和克隆载体骨架的相应序列

T7 DNA聚合酶在FD缓冲液中显示出100％的活性，因此直接加入到连接混合物中

食谱

TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0
1 mM EDTA

致谢

这里描述的方案在以前在Jiang等开发和使用。（2016）。新加坡国立大学新加坡国立医科大学附属新加坡国立大学新加坡国立医学研究委员会（新加坡国立医学研究理事会，新加坡国立医科大学核医学研究中心，新加坡国立医科大学，尼日利亚国立大学，尼日利亚共和国），以及教育部新加坡[学术研究基金（AcRF）第1级教师研究委员会（FRC）授予T1-2011Sep-04和T1-2014Apr-02以及“基础科学研究种子基金”号T1-BSRG 2015-05]。作者宣称相互竞争的经济利益。涵盖主要工作的专利申请正在等待。

参考

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