材料和试剂

移液器提示
培养皿（100毫米）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：263991）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：339652）
0.2μm过滤器（Pall，目录号：4612）
（Eppendorf，目录号：022363204）
扩展棒（Sigma-Aldrich，目录号：Z376779）
S上。肺炎衣原体ST556（Li et al。，2012）
Todd Hewitt肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：T1438）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（BD，Difco TM，目录号：236950）
来自牛肝的过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，目录号：21-040-CV）
Todd Hewitt肉汤用酵母提取物（THY）培养基（见食谱）
TSA培养基（见食谱）
过氧化氢酶工作溶液（见配方）

设备

移液器
解剖显微镜（ZEISS，型号：Stemi 2000-C）
37°C水浴
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：GENESYS TM 30）
37℃5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell＆lt; 150＆gt; 150i）
高压灭菌器（SANYO，型号：MLS-3780）
分析天平（Mettler-Toledo International，型号：NewClassic ML802）
涡街搅拌机
离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
II类生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：MSC-Advantage TM II类）
数码单反相机（佳能，型号：EOS 550D）
直径约5厘米的小镜子

程序

显微镜的设置（视频1）

将夹层显微镜放置在5厘米的长凳上，将两个盒子放在解剖显微镜底座的两侧。
从显微镜下取下照明器。
使用一块胶带将照明器固定在两个盒子之间的工作台表面，并使光源的方向垂直朝向观察者。
取下相机的镜头，并将相机安装在显微镜的顶部。
移除嵌入显微镜底座的物体台。

视频1

制备用于观察菌落形态的肺炎球菌菌落

在37℃的水浴中解冻冷冻的肺炎球菌菌株ST556菌株。
接种5 ml THY培养基，加入50μl解冻的冷冻原料。
将培养物在5％CO 2培养箱中于37℃孵育约5小时。
使用分光光度计检查波长为620nm的培养物的光密度（OD），直到培养物达到对数中期（OD> 620 = 0.4-0.6）。
注意：相变菌落可以由来自新鲜培养物或冷冻原种的细菌细胞形成。如果要使用2d中描述的新鲜培养物进行菌落处理，请转到步骤2g。
将细菌培养物与THY中相同体积的30％甘油混合，并将库存储存在-80℃以备将来使用。
解冻冷冻库存。肺炎链球菌菌株ST556在37℃的水浴中。
用1:100稀释的PBS稀释培养物或解冻的原液至约10μg/ ml集落形成单位（CFU）/ ml。
在室温下解冻冷冻储存的过氧化氢酶工作溶液。
将50μl细菌稀释的液体与100μl过氧化氢酶工作溶液混合，并将混合物铺在TSA板上。
将板在5％CO 2培养箱中于37℃孵育16小时。
注意：在本协议中，我们只检测到肺炎球菌菌株ST556的菌落不透明度的相变。根据我们以前的观察（Li et al。，2016），8个菌株中有6个菌株在16 h时间点显示不透明和透明的菌落表型，如ST556（血清型19F），TH2901（血清型6B）和TH2835（血清型14）。然而，TIGR4（血清型4）和D39（血清型2）在24小时时间点显示不同的集落表型。板的孵育时间应根据您使用的菌株进行调整。

观察肺炎球菌殖民地（视频2）

打开板的盖子（步骤2），将其开口侧的板放在解剖显微镜的台上。
打开照明器，并在显微镜的舞台下使用一个小镜子将光线反射到板上。
调整镜子的光线强度和反射光角度，直到看到殖民地为止。

视频2
根据您的需要调整显微镜的倍率。
调整显微镜的焦点，使您的领域清晰。
打开相机，关闭相机的闪光灯和自动亮度调节系统。
通过稳定地固定镜子的角度。
拍摄殖民地。

数据分析

代表性的图像（图1）说明，肺炎球菌菌株ST556能够在菌落不透明度中自发相变，导致在补充有过氧化氢酶的TSA板上形成不透明和透明的两种类型的菌落形态。

图1.在 S的克隆群体中的不透明和透明菌落之间的相位变化的照片。肺炎支原体菌株ST556 菌株ST556 菌株ST556 。在培养16小时后，代表性的不透明和透明的殖民地分别由红色和蓝色箭头表示。比例尺显示在该图像的右下角（Li 等人，2016）。