材料和试剂

200和1,000μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific）
离心管
Spectra / Por ®透析膜预处理RC管材MWCO：3,500（光谱，目录号：132111）
HiPrep TM DEAE FF 16/10（GE Healthcare，目录号：28936541）
来自M的热水提取物的干粉。日本千叶市富津市渔业协会获得的中华鲟内脏
丙酮（和光纯药工业公司，目录号：011-00357）
乙酸（NACALAI TESQUE，目录号：00212-43）
高氯酸（60％，w / v）（NACALAI TESQUE，目录号：26502-85）
乙醇（99.5％w / v）（NACALAI TESQUE，目录号：14713-53）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）（NACALAI TESQUE，目录号：35406-91）
肌动蛋白酶E（Funakoshi，目录号：KA-001）
氢氧化钠（NaOH）（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
四氢硼酸钠（和光纯药，目录号：192-01472）
氯化十六烷基吡啶鎓一水合物（99.0-102.0％w / v）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：086-06683）
盐酸（HCl）（35.0％w / v）（NACALAI TESQUE，目录号：18321-05）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
无水磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（NACALAI TESQUE，目录号：31720-65）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（NACALAI TESQUE，目录号：31801-05）
Tris醋酸缓冲液（pH 8.0）（参见食谱）
NaOH缓冲液（参见食谱）
十六烷基氯化吡啶溶液（参见食谱）
50mM磷酸钠（pH6）（参见食谱）
在50mM磷酸钠（pH6）中的2.0M NaCl（参见食谱）

设备

冷冻离心机（Sakuma，型号：M200-IVD）
通风柜
锥形瓶（AGC，目录号：4980FK500）
不锈钢勺子（180毫米）
移液器（Gilson，型号：P20，P200和P1000）
Corning ®可重复使用的低烧杯，聚丙烯，尺寸3 L（康宁，目录号：1000P-3L）
搅拌棒
BioShaker（TAITEC，型号：BR-23FP MR）
冷冻干燥机（TOKYO RIKAKIKAI，Eyela，型号：FDU-830）
梯度泵（Bio-Rad Laboratories，型号：ECONO GRADIENT PUMP）
分析天平（Shimadzu，型号：ATX224）

程序

粗GAG的分离
1. 为了从样品中除去脂质，将干燥的粉末（5g）用20ml丙酮悬浮在离心管中，然后在室温下以2,300×g离心样品15分钟。去除上清液。重复这个脱脂步骤三次。离心后，室温干燥样品通风柜过夜。一般来说，将30g干粉脱脂
2. 为了消化核心蛋白质，将脱脂样品溶解在含有肌动蛋白酶E的120ml Tris乙酸盐缓冲液（pH8.0）（参见食谱）中，在锥形瓶中，并在45℃下以100rpm振荡保持18小时。 >
3. 向样品中加入600毫升的NaOH缓冲液（参见食谱），并在4℃静置18小时
4. 在室温下用100ml的2.0N乙酸中和样品，并通过加入高氯酸（最终浓度为5％）沉淀出降解的蛋白质。通过在4℃下以2,300×g离心分离降解的蛋白质15分钟。
5. 将上清液转移到透析膜（MWCO：3,500）中，并在室温下用蒸馏水透析16小时。
6. 将透析的样品溶液转移到新的锥形瓶中。添加CPC解决方案（参见配方）（终浓度为0.1％）并暂停。氯化十六烷基吡啶（CPC），阳离子表面活性剂与GAG的硫酸盐和羧酸盐相互作用。在4℃下保存16小时后，可以观察到锥形瓶中的GAG-CPC复合物。
7. 通过在4℃下以10,000×g离心15分钟收集GAG-CPC复合物，并弃去上清液。
8. 使用不锈钢匙（180毫米）将沉淀物（GAG-CPC复合物）转移到新的锥形管中。为了从GAG-CPC复合物中除去CPC，使用1,000μl移液管将沉淀物重新悬浮在4 ml的2.5 M NaCl中。在4℃下以10,000xg离心溶液15分钟，并将含有GAG的上清液转移到新的锥形管中。
9. 用11体积的85％乙醇悬浮并在4℃下储存16小时。孵育后，通过在4℃以10,000×g离心15分钟收集粗GAG，并除去上清液。用10ml蒸馏水溶解沉淀物
10. 将上清液（溶解的沉淀物）转移到透析膜（MWCO 3,500）中，并在聚丙烯烧杯（3升）中用搅拌棒在2小时的蒸馏水中在室温下透析16小时以从粗产物中除去过量的NaCl聚糖。蒸馏水在透析期间改变5次。
11. 将透析的样品转移到新的锥形管中并冻结。
12. 使用冷冻干燥器将其冻干过夜，得到粗GAG粉末
KS分支CS-E的分馏
1. 将粗GAG（30mg）溶解于2ml蒸馏水中
2. 使用低压液相色谱分离溶解的粗GAG。分级条件：在室温下，在HiPrep DEAE FF上以2ml / min的流速施用ECONO GRADIENT PUMP（Bio-Rad Laboratories）。洗脱液缓冲液如下：（A）50mM磷酸钠（pH6）（参见食谱），（B）在50mM磷酸钠（pH6）中的2.0M NaCl（参见食谱）。梯度程序为0-30分钟（5％B），30-150分钟（5-100％B）和150-180分钟（100％B）。
3. 以30分钟间隔收集分级样品。使用冷冻干燥器干燥分馏的样品，并将样品保持在4°C

数据分析

使用分析天平称量冷冻干燥后的干燥粉末（粗GAG或分馏CS）。

笔记

使用热水中的干粉从中华鲟提取的内脏
粗GAG含有硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素
从M的内脏回收353.8mg粗GAG / g干粉。 chinensis （Higashi等人，2016）。
当通过阴离子交换层析分离时，CS通常在90至150分钟洗脱，而透明质酸（HA）和HS的洗脱时间比CS快。 HA在0至30分钟内洗脱，HS主要在60至90分钟时洗脱
在M的情况下。中成药，从30mg粗GAG（Higashi等人，2016）获得级分3（18.5mg）和级分4（3.73mg）中的分级CS。

食谱

Tris醋酸缓冲液（pH 8.0）
50mM Tris乙酸盐（pH 8.0）
2.5 mg / ml肌动蛋白酶E
NaOH缓冲液
0.5 N NaOH
0.3M四氢硼酸钠
氯化十六烷基吡啶溶液
5％十六烷基吡啶鎓（Cetylpyridinium）氯化物一水合物
30 mM NaCl
50mM磷酸钠（pH6）
50mM磷酸二氢钠，无水（NaH 2 PO 4·4）
50mM磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
在50mM磷酸钠（pH6）中的2.0M NaCl
50mM磷酸二氢钠，无水（NaH 2 PO 4·4）
50mM磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
2.0 M NaCl

致谢

我们感谢Sayaka Masuko博士帮助准备这份手稿。该协议是从原始作品（Higashi等人，2016）中获得的，以提供详细的程序。这项研究部分得到了日本教育，文化，体育，科技和科技研究部门的支持，日本千叶大学的Inohana基金会。

参考

Higashi，K.，Takeda，K.，Mukuno，A.，Okamoto，Y.，Masuko，S.，Linhardt，RJ和Toida，T。（2016）。来自中华猕猴桃的硫酸软骨素葡萄糖醛酸C-3位的硫酸角质素二糖鉴定。生物化学J 473（22）：4145-4158。

Hikino M，Mikami T，Faissner A，Vilela-Silva AC，PavãoMS，Sugahara K.＆nbsp; 硫酸化硫酸皮肤素对胚胎小鼠海马神经元表现出神经突促生长活性：硫酸皮肤素对大脑神经发生的影响。（2003）。 J Biol Chem 278（44）：43744-54。

Maccari，F.，Galeotti，F.，Volpi，N。（2015）。来自骨骼鱼的硫酸软骨素的分离和结构表征 Carbohydr Polym 129：143-147。

MourãoPA，Pereira MS，PavãoMS，Mulloy B，Tollefsen DM，Mowinckel MC，Abildgaard U.（1996）。棘皮动物中岩藻糖化硫酸软骨素的结构和抗凝活性。多糖上的硫酸化岩藻糖分支具有高抗凝作用。生物化学 271（39）：23973-84。