材料和试剂

除了常规用于组织培养中的细胞和免疫沉淀和SDS-PAGE的材料之外，脉冲追踪实验所需的具体试剂是：

移液器提示
1.5 ml微量离心管
细胞培养皿
塑料电池刮板
组织培养基，适合所用的细胞系，不含甲硫氨酸和半胱氨酸
DPBS
二硫苏糖醇（DTT）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒
磷酸酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P2850）
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（Sigma-Aldrich，目录号：R3876）
注意：本产品已停产。
布拉德福比色法测定
蛋白A-Sepharose珠粒
[35 S] - 甲硫氨酸（PerkinElmer，目录号：NEG709A500UC）
甲硫氨酸（250mM的H 2 O，储存在-20℃）（Sigma-Aldrich，目录号：M5308）
半胱氨酸（500mM的H 2 O，储存在-20℃）（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
氯化钠（NaCl）
Triton X-100
乙二胺四乙酸（EDTA）
甘油
Tris-HCl
十二烷基硫酸钠（SDS）
甲醇
乙酸
脉冲（标签）介质（见配方）
追逐媒介（见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
固定溶液（见配方）

设备

移液器
冷藏离心机
95°C热块
细胞培养箱（37℃加湿5％CO 2）
SDS-PAGE装置
射线胶片盒
-80°C冰箱
冰桶
37°C水浴
吸入瓶（安全认可的放射性标记材料）
头顶旋转器
凝胶干燥设备

软件

ImageJ的

程序

通过胰蛋白酶消化收获约1×10 6个贴壁细胞，或收集1-5ml悬浮液中生长的细胞。细胞应处于亚融合状态。
离心细胞在室温下以300×g离心5分钟并吸出培养基。
将细胞沉淀重悬于DPBS中，并通过离心用10ml预热的DPBS洗涤两次
重悬细胞沉淀在200-500μl脉冲培养基中（见食谱）。
在37°C水浴中孵育细胞所需的脉搏持续时间。
通过在4℃下以最大速度离心15秒终止脉冲。
吸出上清液并将细胞沉淀重悬于1ml追踪培养基（37℃，参见食谱）。
在几个时间点（4-8个时间点通常就足够了）。时间点之间的间隔应根据感兴趣的蛋白质的估计半衰期来确定。将等分试样转移到含有1ml冰冷DPBS的新的1.5ml微量离心管中，并保持在冰上。
离心细胞15秒，最高速度在4°C
吸出上清液并将新鲜补充有1mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂混合物，1mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）的适量体积的冰冷裂解缓冲液（参见Recipes）重悬悬浮细胞沉淀。每100μl裂解缓冲液通常有100万个细胞提供合适浓度的细胞裂解物
在缓慢旋转（2-5xg）下，在4℃（冷室）下孵育细胞裂解物20分钟。
在4℃以13,000 x g离心裂解物15分钟，以除去不溶物质和细胞碎片。
将澄清的裂解物转移到新鲜管中，并丢弃沉淀。
注意：对于贴壁细胞，当将细胞连接到组织培养皿而不进行胰蛋白酶消化时，也可以应用该方案，通过在相同的汇合处使用几个细胞，每个时间点一个。然而，在这种情况下，应该快速添加脉冲和追踪介质，以避免菜肴中脉冲/追逐时间的变化，特别是在施加短时间间隔时。在这种情况下，细胞裂解是通过将裂解缓冲液直接加入到细胞单层中，同时在冰上孵育10分钟，然后使用刮刀收集细胞裂解物。将含有裂解物的管在冰上保持另外10分钟，偶尔倒置。然后将裂解物在4℃以13,000×g离心15分钟以除去不溶物质，将澄清的裂解物转移至新鲜管中。
使用Bradford比色法测定不同等分试样/时间点的总细胞裂解物中的蛋白质浓度，并使用新添加的裂解缓冲液将裂解物的浓度调节至约1mg / ml。
继续进行免疫沉淀步骤：将免疫沉淀应用的推荐稀释液与50μl10％蛋白A-Sepharose珠和0.5mg蛋白质（约500μl裂解物）一起添加到目标蛋白质上。摇头或旋转头顶。在4℃下恒温旋转1-2小时或在4℃（冷室）下缓慢旋转（2-5xg）过夜孵育。
通过在4℃下以300×g离心2分钟来将免疫沉淀的复合物颗粒化。
取出上清液，并以300×g离心3分钟洗涤珠子复合物2分钟，弃去上清液并加入1毫升冰冷的洗涤缓冲液（参见食谱）。
将珠重悬在20μl4x SDS样品缓冲液中，并在95°C热块上煮沸样品5分钟。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶上。
注意：分离凝胶中丙烯酰胺的丙烯酰胺百分比应根据感兴趣的蛋白质的大小来确定：蛋白质的分子量越高，凝胶的使用百分比越小。
以恒定的50mA运行堆叠凝胶，70mA用于分离凝胶。
用10ml固定溶液（50％甲醇+ 10％乙酸）固定凝胶1小时，缓慢摇摆。
干燥凝胶在凝胶干燥器中在-80℃下1.5小时。
在室温下将胶片暴露于放射性凝胶过夜。
使用ImageJ等成像软件量化电影图像。

数据分析

脉冲追踪法是研究蛋白质折叠，成熟，细胞内运输和降解的有力工具。最近在Elgendy等人，2017中展示了一种演示脉冲跟踪技术的功能和适用性的实例。在这项研究中，采用脉冲追踪技术来研究脉冲追踪技术的稳定性用舒尼替尼治疗癌细胞时MCL-1癌蛋白。舒尼替尼，多激蛋白抑制剂，是最广泛使用的靶向治疗之一（Elgendy，2017）。然而，大多数患者最终复发继发于舒尼替尼耐药（Cella et al。，2015）。我们的工作表明，舒尼替尼耐药性与MCL-1癌蛋白（Elgendy等人，2017; Elgendy，2017）的稳定性增强有关。 MCL-1是Bcl-2蛋白家族的主要生存成员，其表现出独特的特征，包括其严格的法规和短的半衰期（Elgendy等人，2014; Elgendy和Minucci，2015））。采用脉冲追踪方法，舒尼替尼治疗已显示出增强MCL-1的稳定性。简言之，将HCT116细胞在含有甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中孵育30分钟，然后在含有200-500μCi的[35℃]半胱氨酸/甲硫氨酸的标记培养基中于37℃孵育2小时。标记后，在37℃下用含有10％FBS和5mM冷甲硫氨酸的完全DMEM追踪细胞，并且在未指定的时间点内未处理或用舒尼替尼处理。然后将MCL-1从裂解物中免疫沉淀并通过放射自显影进行分析。

笔记

应对每种感兴趣的蛋白质优化免疫沉淀方案，通过微调几个变量，找到最佳信号与背景比的最佳组合。最重要的变量是：

裂解和洗涤缓冲液的组成，主要是缓冲液中使用的洗涤剂的类型和浓度以及缓冲液的严格性。一些核蛋白和结构蛋白将需要苛刻的裂解条件，其中裂解缓冲液含有SDS
所用抗体的浓度。如果感兴趣的蛋白质不那么丰富，可以使用更高浓度的抗体。
使用的总裂解物的量。这是由所使用的细胞类型中所关注的蛋白质的丰度确定的。使用的裂解物的量越高，对珠子的非特异性结合越多，背景越高。
通过与单独的珠子或与不含特异性抗体的对照IgG预孵育来包括或排除裂解物的预清除步骤，以除去非特异性粘附到珠粒上的"粘性"蛋白质。
抗体，珠粒和裂解液孵育的顺序和持续时间。通常应先尝试较短的孵化时间，以减少背景，如果需要，可以将其升高至4℃过夜孵育。
洗涤步骤的温度和数量：温度越高，背景越低

食谱

脉冲（标签）介质
含有半胱氨酸和不含蛋氨酸的组织培养基含有：
10 mM HEPES，pH 7.4
125-500μCi[35] S半胱氨酸和/或甲硫氨酸/ ml
追逐媒介
完整的组织培养基包含：
10 mM HEPES
5 mM半胱氨酸
5 mM甲硫氨酸
裂解缓冲液
150 mM NaCl
50 mM HEPES，pH 7.5
1％Triton X-100
1 mM EDTA
10％甘油
洗涤缓冲液
20毫升Tris-HCl，pH 7.4 150毫米NaCl
0.1％SDS
1毫升EDTA
固定解决方案
50％甲醇
10％乙酸

致谢

该协议由Elgendy等人（2017）进行了改编。 [Elgendy，M.，Abdel-Aziz，AK，Renne，SL，Bornaghi，V.，Procopio，G.，Colecchia，M.，Kanesvaran，R.，Toh，CK，Bossi，D.，Pallavicini， Perez-Gracia，JL，Lozano，MD，Giandomenico，V.，Mercurio，C.，Lanfrancone，L.，Fazio，N.，Nole，F.，Teh，BT，Renne，G。和Minucci，S。（2017 ）。 MCL-1和mTOR的双重调制决定了对于舒尼替尼的反应。 J Clin Invest 127（1）：153-168。]我接受了Mahlke-Obermann基金会和欧盟第七框架计划/ FP7 Marie Curie行动赠款协议号609431 / INDICAR-跨学科癌症研究。

参考

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Elgendy，M.，Abdel-Aziz，AK，Renne，SL，Bornaghi，V.，Procopio，G.，Colecchia，M.，Kanesvaran，R.，Toh，CK，Bossi，D.，Pallavicini，I.，Perez -Gracia，JL，Lozano，MD，Giandomenico，V.，Mercurio，C.，Lanfrancone，L.，Fazio，N.，Nole，F.，Teh，BT，Renne，G.and Minucci，S。（2017）。 MCL-1和mTOR的双重调制决定了响应至舒尼替尼。 J Clin Invest 127（1）：153-168。
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