材料和试剂

1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
飞筛：106，355，600和850 mm
IgG Sepharose Fast Flow Beads（GE Healthcare Dharmacon，目录号：17-0969-01）
AcTEV蛋白酶（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：12575-015）
钙调蛋白琼脂糖4B（GE Healthcare Dharmacon，目录号：17-0529-01）
Micro Bio-Spin柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6204）
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶（Life Technologies，目录号：NP0321）
Silverquest银染色试剂盒（Life Technologies，目录号：LC6070），胶体蓝染色试剂盒（Life Technologies，目录号：LC6025）或考马斯蓝。
β-巯基乙醇
1 M CaCl 2
Hepes
MgCl 2
KCl
NP-40
DTT
Na 3 3 VO 4
EDTA
EGTA
NaF
甘油
醋酸镁
咪唑
Bouwmeester的缓冲区（见Recipes）
缓冲液A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）
缓冲液C（参见配方）
TEV裂解缓冲液（见配方）
钙调蛋白结合缓冲液（参见配方）
钙调素清除缓冲区（参见配方）

设备

台式离心机（适用于1.5 ml微量离心管）
1.5ml微量离心管
营养器
Vortexer
陶瓷砂浆和杵
Dounce匀浆器
1.5ml管的一次性杵
Beckman台式离心机（适用于15 ml和50 ml锥形管，可以冷却至4°C）
Sorvall与Beckman JA-20转子，能够冷却至4°C
质谱设备

程序

蛋白复合物的分离
1. 对于从果蝇卵巢中分离蛋白质复合物：
  1. 饲料（1-3天龄）用酵母糊状物表达TAP-标记的蛋白质三天。
  2. 解剖卵巢在1×PBS，收集在1.5毫升微量离心管，并在-80℃冷冻。收集超过200对卵巢。可以在几轮独立的解剖后收集卵巢，并冷冻以收集适当的量。
  3. 使用适合1.5ml微量离心管的一次性杵在1ml Bouwmeester's缓冲液中匀浆卵巢。
  4. 在冰上孵育20分钟，并转移到Beckman离心管（1/2 x 2英寸）
  5. 在4℃，20,000×g下旋转管15分钟。
  6. 取出并保存在冰上的上清液。这是你的细胞质提取物。
  7. 在4℃下旋转管，100,000xxg，在另外旋转后45分钟以除去剩余的提取物。
  8. 取出并保存在冰上的上清液。这是你的核提取物（可以组合步骤A6和A8的提取，如果你想要提取物，或保持分离）。
  9. 从每个离体提取物中取出20μl作为裂解物对照（对照A）。在液氮中冷冻并储存在-80℃。转到第2节：蛋白复合物下降的步骤#a
2. span style ="color：＃666666; font-family：Arial，Helvetica，sans-serif; font-size：13.333333015441895px; line-height：20px; text-align：justify; white-space：normal;">复杂的隔离从果蝇头：
  1. 在-80℃下冷冻表达感兴趣的TAP标记的蛋白质。你需要至少50毫升的冷冻苍蝇开始。在标准规模称重起始材料，并确保至少有1克头。
  2. 冷却筛在液氮中准备用于头部爆破程序
  3. 流行音乐使用液氮和适当大小的网格（ http：//cmgm.stanford。 edu /〜vesicle/protocols/droshead.html ）。将纯化的头部样品保存在干冰上或-80°C，直到您准备好下一步。
  4. 使用液氮预冷冻研钵和杵。添加头和液氮到冷冻的研钵和杵，研磨样品在干冰上，继续加入液氮直到你有一个细粉。
  5. 当你有细粉时，加入更多的液氮将粉末倒入50ml的falcon管中
  6. 让液氮在未覆盖的管中脱气5-10分钟
  7. 加入2毫升bouwmeester缓冲液粉末，转移到dounce匀浆器和dounce匀浆10次。转移到几个1.5毫升微量离心管。在4℃下旋转15分钟，15,000xg，除去上清液，并重复旋转以除去尽可能多的上清液。
  8. 从每个样品中取出20μl作为裂解物对照（对照A）。在液氮中快速冷冻并储存在-80℃
蛋白复合物的下降
1. 准备200微升IgG Sepharose Fast Flow珠在15毫升falcon管，用500微升缓冲液B（添加100微升PIC和5微升DTT新鲜到10毫升缓冲液B）洗涤两次。用缓冲液B每次洗涤后，在Beckman台式离心机中在4℃，100×g旋转2分钟，除去上清液。
2. 加入裂解物并在4℃下在营养师上旋转过夜
3. 孵育过夜后，在4℃下，在Beckman台式离心机中100×g离心5分钟，除去上清液。保存20微升的上清后孵化控制（对照B）。
4. 在1ml缓冲液B中洗涤珠3次。在Beckman台式离心机中每次洗涤后，在4℃，100×g下旋转2分钟。
5. 在1ml缓冲液C中洗涤珠4次。在Beckman台式离心机中每次洗涤后，在4℃，100×g下旋转2分钟。
6. 在1ml TEV裂解缓冲液中洗涤两次。在Beckman台式离心机中每次洗涤后，在4℃，100×g下旋转2分钟。取出10微升珠作为对照（对照C）
7. 加入400微升TEV裂解缓冲液和4微升AcTEV蛋白酶到珠子，并转移到1.5毫升微量离心管。在4℃下在旋转器上旋转过夜。
8. 在台式离心机中在4℃下旋转300分钟，1分钟。
9. 取出上清液，加入0.6μl1M CaCl 2 /200μl上清液（通常为1.2μl，400μl总上清液）。
10. 准备1.5毫升微量离心管与100微升钙调蛋白琼脂糖树脂和用500微升钙调蛋白结合缓冲液洗涤两次。旋转2分钟，1,500rpm，每次洗涤后4℃
11. 加入3倍体积的钙调蛋白结合缓冲液到上清液，并将其添加到制备的钙调蛋白树脂。在4℃下旋转3-4小时。
12. 旋转2分钟，1,500rpm，4℃。
13. 用500μl钙调蛋白结合缓冲液洗涤三次。旋转2分钟，1,500rpm，每次洗涤后4℃
14. 使用优选策略用Calmodulin洗脱缓冲液洗脱TAP标记的蛋白质
15. 在4-12％Bis-Tris 10孔凝胶上进行洗脱
16. 运行控制和蛋白梯在独立的凝胶从最终洗脱液，所以没有污染
17. 用考马斯蓝，胶体蓝染色试剂盒或Silverquest试剂盒染色。剪切感兴趣的带并发送到质谱设备。

食谱

注意：制备不含蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液而不使用EDTA（PIC w/o EDTA），Na 3+，VO 4，CaCl 2和 /或DTT。这些应在使用前立即添加。

缓冲液A（20ml）
见上面的注解

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Hepes（pH7.9）	200毫升	10mM Hepes
1 M MgCl 2	30ml	1.5mM MgCl 2
2 M KCl	100毫升	10mM KCl
1 M DTT	10毫升	0.5mM DTT
PIC w/o EDTA	20毫升	1x
H 2 O	至20mL

Bouwmeester缓冲液（20ml）
过滤器消毒并存储在4 °C 。见上面的注解

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Tris-HCl（pH7.5）	1ml	50mM Tris-HCl
5 M NaCl	2.5ml	125mM NaCl
100％甘油	1ml	5％甘油
100％NP-40	80ml	0.2％NP-40
1 M MgCl 2	30ml	1.5mM MgCl 2
1 M DTT	20毫升	1mM DTT
1 M NaF	500ml	25mM NaF
200mM Na 3 VO 4	100毫升	1mM Na 3 VO 4
500mM EDTA	40ml	1mM EDTA
2mM EGTA	80ml	500mM EGTA
PIC w/o EDTA	20毫升	1x
H 2 O	至20mL

缓冲液B（20ml）
在实验当天更新
见上面的注解

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Hepes（pH7.9）	400ml	20mM Hepes
87％甘油	4.6ml	20％甘油
100％NP-40	200毫升	0.5％NP-40
2 M KCl	2.5ml	200mM KCl
1 M DTT	10毫升	0.5mM DTT
500mM EDTA	40ml	1mM EDTA
20mM EGTA	80ml	500mM EGTA
PIC w/o EDTA	200毫升	1x
H 2 O	至20mL

缓冲液C（20ml）
见上面的注解

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Hepes（pH7.9）	400ml	20mM Hepes
87％甘油	4.6ml	20％甘油
100％NP-40	200毫升	0.5％NP-40
2 M KCl	2.5ml	200mM KCl
1 M DTT	10毫升	0.5mM DTT
H 2 O	至20mL

TEV裂解缓冲液（100ml）过滤灭菌
见上面的注解

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Tris-HCl（pH8.0）	1ml	10mM Tris-HCl
5 M NaCl	3ml	150mM NaCl
20％NP-40	500ml	0.1％NP-40
1 M DTT	50毫升	0.5mM EDTA
H 2 O	至100毫升

钙调蛋白结合缓冲液（100ml）

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Tris-HCl（pH8.0）	1ml	10mM Tris-HCl
β-巯基乙醇	69.7ml	10 mM β-巯基乙醇
5 M NaCl	3ml	150mM NaCl
1M Mg-乙酸盐	100毫升	1mM乙酸镁
1 M咪唑	100毫升	1mM咪唑
1 M CaCl 2	200毫升	2mM CaCl 2
20％NP-40	500ml	0.1％NP-40
H 2 O	至100毫升

钙调蛋白洗脱缓冲液（100ml）

库存和浓度	卷	最终浓度
1M Tris-HCl（pH8.0）	1ml	10mM Tris-HCl
β-巯基乙醇	69.7ml	10mMβ-巯基乙醇
5 M NaCl	3ml	150mM NaCl
1M Mg-乙酸盐	100毫升	1mM乙酸镁
1 M咪唑	100毫升	1mM咪唑
20％NP-40	500ml	0.1％NP-40
2 mm EGTA	400ml	500mM EGTA
H 2 O	至100毫升

致谢

该方案从酵母细胞中使用的原始方法修改而来（Pugi等人，2001; Rigaut等人，1999）。

参考文献

Bhogal，B.，Jepson，J.E.，Savva，Y.A.，Pepper，A.S.，Reenan，R.A。和Jongens，T.A。（2011）。由果蝇脆弱X智力迟钝蛋白调节dADAR依赖性RNA编辑。 em> Nat Neurosci 14（12）：1517-1524。
Puig，O.，Caspary，F.，Rigaut，G.，Rutz，B.，Bouveret，E.，Bragado-Nilsson，E.，Wilm，M.and Seraphin，B。串联亲和纯化（TAP）方法：蛋白复合物纯化的一般程序。方法 24（3）：218-229。
Rigaut，G.，Shevchenko，A.，Rutz，B.，Wilm，M.，Mann，M。和Seraphin，B。（1999）。用于蛋白质复合物表征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法。 Nat Biotechnol 17（10）：1030-1032。
Tsai，A.and Carstens，R.P。（2006）。使用串联亲和纯化方法在培养的哺乳动物细胞中进行蛋白纯化的优化方案。 Nat Protoc 1（6）：2820-2827。