材料和试剂

电工胶带（Temflex TM 1700,3M，目录号：1700-1X66FT）
一次性称量船
大鼠（Long-Evans，250-300g;雄性; 7周龄; Charles River Laboratories）
无钠食品（TestDiet;订单信息：1816123（5ANR），TD 90228 1/2）
糖（纯蔗糖粒，Domino ）
盐（加碘，莫顿盐公司）
无糖Kool-Aid粉（橙和葡萄，Kool-Aid，卡夫食品公司）
速尿（Salix ，Merck）

设备

偏好测试室（29.5 x 12.5 x 21英寸，定制设计;达特茅斯仪器店）
16盎司。螺杆瓶（Ancare，产品目录号：MST16）
螺旋顶部弯曲球pt。（5英寸长，1英寸弯头，Ancare，目录号：PCST51BTD）
数码摄像机（索尼）
2个便携式灯具（UL，目录号：E196460）
2个红色灯泡（Sunlite，产品目录号：SL24 / R）

程序

准备动物
这个程序是为老鼠设计的。在整个实验过程中，大鼠的食物都受到限制并保持在其自由采食量的85％，以激励他们饮用蔗糖和盐溶液。
仪器的准备
1. 行为训练是在达特茅斯器械商店（图1）制作的定制设计的地点偏好室（29.5 x 12.5 x 21英寸）中进行的。腔室的外壁由透明的丙烯酸树脂制成，并且可以放置在腔室中的丙烯酸插入件将其分成三个独立的环境。除了便携式灯具提供的红光（见图1）以外，所有的培训和测试均在黑暗中进行，以便为记录目的提供足够的照明。
  
  图1.调查环境驱动的寻盐和关闭地点偏好室的视图的设置
2. 腔体内的两个环境（12.5 x 12.5 x 18.5英寸）与两个解决方案中的一个配对，而第三个中间环境（5 x 12. 5 x 18.5英寸）连接另外两个环境并且没有配对。配对的上下文之一被指定为网格上下文。网格环境中有一个透明的丙烯酸地板，网格状图案，外壁上有电气胶带，形成网格状图案。另一个配对上下文被指定为条纹上下文。条纹背景具有相同的网格图案的地板，但外墙具有平行对角线图案的电磁带。这两种情境中的每一种都有一个区别对象来帮助辨别（例如金属活页夹或空的塑料显微镜盖玻片情况）。两种情况在两端都有漏洞，以允许连接到充满解决方案的瓶子的喷口供老鼠饮用。
3. 连接网格和条纹上下文的第三个中间上下文被指定为仅包含透明丙烯酸墙壁的中性上下文，并且是每个培训和测试会话的起点。虽然个体老鼠有时候自然会喜欢上下文，但重要的是首先确定对另一个上下文没有普遍的偏见。如果有的话，可以进行调整（例如，照明，房间方向，等等）。
行为训练和测试协议
第1步：培训
1. 大鼠进行为期8天的初始训练，其中他们学习将一种情况（格栅或条纹）与3％蔗糖在蒸馏水中的接触联系起来，另一种情况下接触蒸馏水中3％的盐。每种溶液都混有2克无糖Kool-Aid粉（橙或葡萄），以帮助区分两种情况和解决方案。上下文，解决方案和Kool-Aid风味配对的分配在大鼠之间是平衡的，但在每只大鼠中保持不变。
2. 在每个训练日（每种情况下总共4天）中，将大鼠置于中性背景中并允许自由探索一个背景（网格或条纹）20分钟。访问其他配对的上下文被阻止。在这些过程中，允许大鼠从一瓶100ml的蔗糖或盐（如图2的步骤1中的橙色和紫色瓶）中自由饮用。上下文暴露的顺序是伪随机分配给老鼠的。
  
  图2.行为训练和测试程序，用于研究上下文驱动的大鼠寻盐过程。第一步：大鼠接受8天的培训，将一种情况与获得蔗糖联系起来（ >，Grid）和另一个可以访问salt的上下文（，例如，Striped）。步骤2：然后给大鼠一个基线测试期，在这个测试期中，他们可以在没有蔗糖或盐的情况下使用这两种情况（但仍然存在有味的溶液）。经过4天的再训练（在每种情况下2天）后，通过速尿（i.p.）给大鼠排出体内钠。步骤3：48小时后，将大鼠放回腔室进行与基线测试阶段相同的耗尽测试。步骤4：最后，给大鼠进行与之前的测试相同的消费测试，但现在可以获得蔗糖和盐。所有的培训和测试都是20分钟。
第2步：基线测试
1. 一旦初始训练完成，大鼠接着进行20分钟的基线首选测试，其中允许他们首次探测整个腔室（包括网格和条纹背景）（两个壁插入物都被移除）。本次测试中的网格和条纹上下文与训练中的相同。一个重要的例外是蔗糖和盐不存在于调味溶液中。我们以这种方式进行基线偏好测试，以测量老鼠使用房间的情境提示来指导他们的行为的能力。该测试作为钠耗竭后进行的相同测试的重要比较点。
再培训和钠耗竭
1. 在基线测试阶段之后，对老鼠进行另外4天的训练（在每种情况下2次训练），这与初始训练阶段相同（步骤1）。我们给予老鼠额外4天的训练，以重新加强蔗糖和盐之间的关联，并且各自的情况可能会在基线偏好测试后减弱。在最后一次训练之后，给大鼠全身注射利尿速尿（10mg / ml / kg; i.p。; Merck）。为了维持钠剥夺，在注射呋塞米后，大鼠也立即保持无钠饮食（TestDiet）和蒸馏水。
第3步：耗尽测试
1. 呋塞米注射后48小时，然后给予大鼠另一情境偏好测试（耗竭测试）。该测试与基线偏好测试相同（即，完整的室可用;有风味的溶液可用，但不含盐或蔗糖），除了现在大鼠钠剥夺之外。我们通过这种方式进行耗竭测试，以便直接比较钠耗竭后在盐配对环境中花费的时间与基线偏好测试相比所花费的时间。
第4步：消费测试
1. 第二天，给予大鼠蔗糖和现在存在于调味溶液中的盐（消耗测试）的最终上下文偏好测试。这使我们有机会证实大鼠确实缺钠。它还进一步提供了一个机会，可以研究在耗尽钠后，上下文驱动的寻盐（耗竭测试）和盐消耗（消耗测试）之间任何可能的神经解离。在完成这个测试后，大鼠被放回正常的食物和饮水。

数据分析

测试会议的视频由数码相机（索尼）记录，该数码相机安装在面向室内一侧的三脚架上并定位，以便可以看到整个室。要分析的主要措施是在培训和测试会话期间消耗的解决方案数量（单位为毫升），测试会话期间每个配对上下文的条目数量，测试期间每个配对上下文（以秒为单位）花费的时间量，以及在测试会话期间花费解决方案的时间（以秒为单位）。每种情况下消耗的时间量和消耗解决方案的时间量也被分解为5分钟的块，以更详细地记录老鼠的行为随时间变化的情况。行为是通过查看每只老鼠的头部位置以及它所处的位置，以最近的秒计算的，从而进行离线手动评分。另外，可以通过计算耗竭和基线测试之间的总差异来计算每个测量的高程得分。自动化的视频追踪设备可以用来替代视频评分。
除了体积消耗之外，喷嘴式测厚仪还可用于评估舔微结构
对于具有来自每个主题的多个数据点（例如，，训练消耗数据或5分钟块数据）的分析，使用重复测量ANOVA。对于基于先验测试计划的来自每个主题的单个数据点的分析（例如，高程分数），可以使用广义线性模型。 Bonferroni校正后的广义线性模型跟踪了重要的相互作用。否则，所有分析都有一个拒绝标准： P < 0.05。
图3显示了在我们的盐食欲程序中（n = 19只雄性大鼠;组平均值±SEM;改编自Chang等人，2017）对于对照组大鼠的预期观察结果。在训练过程中，大鼠应该比盐饮用更多的蔗糖（图3A）。在耗竭钠后，与基线试验相比，耗竭试验期间大鼠应在盐配对情况下显示出花费的时间增加（图3B）。最后，在钠消耗后每只溶液与大鼠最后训练日相比，大鼠应该在盐摄入量和蔗糖消耗量方面显示出上升（图3C）。在耗竭和消耗测试过程中的神经操作可能揭示在钠耗竭后情境驱动的寻盐和盐消耗之间的分离。一个突出的例子是我们之前的研究（Chang等人，2017），在这个研究中，我们观察到在情境驱动的寻盐过程中存在特定的缺陷，但是在缺乏钠盐并伴随VP的光遗传抑制之后没有盐消耗。

图3.我们盐分食欲程序的预期结果A.在训练过程中，大鼠应该比盐饮用更多的蔗糖。 B.在盐配对情况下，大鼠应该表现出消耗时间的增加以及在耗竭测试期间钠消耗后与蔗糖配对情境下花费的时间的减少。 C.与最后一个训练日相比，大鼠在消耗盐量和蔗糖消耗量方面有所上升，而钠消耗后每种溶液都有所增加。数据摘自Chang et al。，2017。

笔记

虽然我们使用球pt。当在每次会议开始之前将瓶子放置到位时，仍可能有一些泄漏的解决方案。为了最大限度地减少泄漏造成的溶液损失，我们在腔室底部的出口下方放置一个收集盘（，例如，一次性称重船），以收集在老鼠出现之前可能泄漏的任何溶液放入室内。一旦瓶子就位约5分钟，然后在大鼠被放入腔室之前将收集盘移除。然后将收集盘中的溶液添加到每次会话后留在瓶中的剩余物中，以提供对每次会话期间实际消耗的老鼠数量的更准确测量。
无论在基线测试期间与哪个解决方案配对，某些个体老鼠可能在每个环境中花费的时间方面表现出对该室的一个环境的偏见。然而，最重要的是在耗竭测试期间在每个环境中花费的时间的提升，这是衡量盐食欲现象的主要措施。我们一直观察到，在使用这种测量方法的对照大鼠中钠耗尽后，在盐配对环境中花费的时间强劲增加，尽管大鼠对一种情况或另一种情境可能具有任何固有偏差。
我们只使用雄性大鼠进行这一程序，但我们不希望看到雄性和雌性大鼠之间的差异。

食谱

对于培训课程，我们将每个解决方案制成1 L批次。因此，称取30g糖或盐并放入1L瓶中。然后用蒸馏水将瓶子充满1L。最后，加入2克无糖Kool-Aid粉（橙或葡萄）。然后混合溶液直至糖或盐（和Kool-Aid粉）溶解。
对于测试环节，1L批次只装满蒸馏水和2克Kool-Aid粉末。
呋塞米初始浓度为5％，用蒸馏水（例如5毫升呋塞米和20毫升蒸馏水）稀释至1％，浓度为10毫克/毫升。 br />

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款F32MH106178（SEC）和白厅基金研究基金2014-05-77（KSS）的资助。作者声明没有竞争的财务利益。该协议改编自Chang等人，2017年。

参考

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