第一部分：INTACT纯化核

材料和试剂

移液器吸头（P20，P200和P1000，无核酸酶，例如，美国科学公司，产品目录号：1123-1710，1120-8780，1126-7510）
（可选）13毫升Falcon管
30微米细胞过滤器（Sysmex，CellTrics，目录号：04-004-2326）
15ml Falcon管（无核酸酶，例如VWR，目录号：89039-666）
1.5ml Eppendorf管（无核酸酶，例如Denville Scientific，目录号：C2170）
巴斯德移液管（无核酸酶，例如，Phenix Research Products，目录号：PP-137038C）
幻灯片＆nbsp;
盖帽＆nbsp;
PCR管带（无核酸酶，例如，美国科学公司，目录号：1402-2708）
0.22μm注射器过滤器（如，Merck，产品目录号：SLGP033RB）
50ml Falcon管（无核酸酶，例如VWR，目录号：89039-658）
铝箔
具有生物素标记核的转基因植物组织
INTACT二元载体（Ron等人，2014; Reynoso等人，2018）
注意：它们将可在 https：//gateway.psb。 ugent.be/search 。这些质粒允许将您选择的启动子的T-DNA插入您选择的植物物种中。
液氮
M-280抗生蛋白链菌素Dynabeads（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11205D）
NaOH
MOPS（Sigma-Aldrich，目录号：M1254-25G）
氯化钠（NaCl）（例如，Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化钾（KCl）（例如，Fisher Scientific，目录号：BP366-1）
乙二胺四乙酸（EDTA）（例如，Fisher Scientific，目录号：S311）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889-25G）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S1141）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）或完全微型蛋白酶抑制剂片剂不含EDTA（Roche Diagnostics，目录号：11836170001）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：648466）
碘化丙啶（PI）染色（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
10 N NaOH（见食谱）
0.5 M MOPS，pH 7（见食谱）
1 M NaCl（见食谱）
2 M KCl（见食谱）
0.5 M EDTA（见食谱）
0.5米EGTA（见食谱）
0.2 M精胺（见食谱）
0.2 M亚精胺（见食谱）
10％Triton X-100（见食谱）
Nuclei纯化缓冲液碱（见食谱）
NPB和NPBt缓冲液（见食谱）
碘化丙啶（PI）污渍（见食谱）

设备

移液器（P20，P200，P1000;例如Eppendorf，产品目录号：3123000039,312000055,3123000063）
陶瓷研钵和研杵（用RNase Zap [Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：AM9780]或其他RNase去除产品擦拭干净）
对15ml Falcon管进行离心（例如，Eppendorf，型号：5810R）。
Dynamag TM -15 Magnet（Thermo Fisher Scientific，型号：Dynamag TM -15，目录号：12301D）
注：可以用自制版本替换。例如，一个强大的稀土（钕）磁铁（例如，1 x 10厘米长的条形码）可以在50毫升猎鹰管内粘贴，并且可以添加衬垫以保持15毫升Falcon管在磁铁旁边（参见图1 ）。

图1.两支15毫升猎鹰管的自制磁铁两个钕磁铁放置在装在管架上的50毫升Falcon管内。两个磁铁之间的吸引力将它们固定在位。为了支撑15毫升管子抵抗磁铁的位置，纸巾被粘在50毫升管子内。
Dynamag TM-2 Magnet（Thermo Fisher Scientific，型号：Dynamag TM -2，目录号：12321D），或者这个的自制版本。
血细胞计数器（SCK Films，In-Cyto，产品目录号：DHC-N01-2）
BD Adams TM Nutator TM Single-Speed Orbital Mixer（，Fisher Scientific，目录号：14-062）
制造商：BD，目录号：421105 / DEL。
4°C的冰箱和/或冷藏室
带滤光片的荧光显微镜可以观察DAPI或PI染色（Edmund Optics，目录号：86-371,67-008）

程序

图2提供了过程的概述，包括可选的检查点。

图2.概述第I部分中的步骤的流程图：INTACT纯化核

注：对于计划使用INTACT纯化细胞核进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验（本协议未描述）的研究人员来说：为进行ChIP实验，新鲜组织需要交联。

通过将所有起始组织放入具有1％甲醛的30ml NPB（Sigma-Aldrich，F8775）在50ml Falcon管中，并将组织在真空下孵育10分钟，将蛋白质交联至DNA。
将甘氨酸（Fisher Scientific，BP381）加至终浓度为0.125M，置于真空下5分钟以上。
用水清洗组织3次，并擦干。＆nbsp;

从冷冻物质中分离核
1. 根据需要准备新鲜的NPB和NPBt缓冲液（每个样品约15 ml NPB和45 ml NBPt）并在冰上冷却缓冲液。我们建议一次处理最多八个样本。
2. 在液氮中用陶瓷研钵和杵研磨冷冻组织（50-200厘米1厘米根尖，200根根尖180毫克），直到非常细。
  可选：将粉末倒入13毫升Falcon管中并称重样品。用液氮冷却一切，不要让样品解冻。
3. 用移液管将约8 ml冰冷的NPB加入研钵中，轻轻研磨以重新悬浮粉状组织（对较大样品按比例放大）。 NPB不会冻结是非常重要的，所以要么使用最少量的液氮进行研磨，要么移动到新的砂浆中进行这一步骤。
4. 通过30μm细胞过滤器将悬浮液过滤到15 ml Falcon管中，并在处理其余样品时将Falcon管置于冰上。
5. 在4°C（在Eppendorf 5810 R离心机上以2,229 rpm）离心过滤的细胞核1000 x g，15分钟。
6. 准备在1.5毫升管（每个样品一个）的链霉亲和素珠。为每个样品清洗25μlInvitrogen M-280 Streptavidin Dynabeads。为了清洗珠子，将充分混合的珠子移入1.5ml管中，放置在磁体上，除去上清液，加入并与1ml NPB混合，放置在磁体上，除去上清液，重新悬浮在原始体积的NPB中（50μl ）。
7. 将Falcon管从离心机移至冰上。
  可选：标记上清液（SN）的体积并将10％的上清液用于蛋白质印迹（'SN1000' - 如果您想确认您的上清液中没有丢失任何细胞核/生物素信号）。
  1. 弃去上清液（小心倒入）。
  2. 通过上下吸取将1ml冷NPB中的细胞核重新悬浮。换句话说，在核颗粒上从移液管释放缓冲液直到颗粒完全重新悬浮。
  3. 留出11μl重悬的核用于定量和产量计算（PCR条效果良好）。见程序B.
    可选：为Western印迹（样品中生物素信号的总量）预留10％重悬'P1000'（Pellet）。
8. 将重新悬浮的细胞核（〜1ml）转移到洗涤过的珠上（在1.5ml管中）。在4°C的条件下，在nutator上旋转管（约20 rpm）30分钟，将核膜包被的生物素结合到珠子上的链霉亲和素上。
9. 在15ml Falcon管中用14ml NPBt稀释1ml珠 - 核混合物。轻轻混合并置于4°C的章动器（约20 rpm）30秒。
  在4°C放置磁铁15-20分钟。
  可选：预留10％的上清液进行Western印迹（'Unbound'）。
10. 用巴氏吸管小心地取出上清液，轻轻地将悬浮液重悬于14ml NPBt中。轻轻混合并置于4°C的章动器（约20 rpm）30秒。
  将管子放在磁铁上10分钟（4°C）。
11. 重复步骤A10。
12. 轻轻去除上清液。在1毫升NPBt中重悬珠。
  预留11微升核用于定量和产量计算（PCR条效果良好）。见程序B.
  可选：将10％的重悬微珠用于蛋白质印迹（“结合”以确保大部分生物素化信号在此处）。
13. 将1ml重悬液转移到1.5ml管中并捕获在磁体上。
14. 取出上清液，用20μlNPB重悬珠。
  注意：只有在计数和等分后，才能冻结核。
用血细胞计数器计数核以量化产量
1. 用0.5μl10μg/ ml碘化丙啶（PI）染色混合11μl细胞核（来自步骤A14的珠粒或来自步骤A7c的重悬浮丸粒）。成像前，让细胞核染色至少5分钟。
2. 吸取10微升样品到血球计上。一个血细胞计数器有两个位置，A和B，用于计数原子核，因此您需要一个血球计数器来计数两个样品。将样品移液到半月形区域，推动载玻片和盖玻片之间的细胞核再悬浮（图3）。
3. 在荧光灯下观察样品并使用适合PI的过滤器，使用计数网格对核进行计数（图3）。用它来计算总样品中的核数。＆nbsp;
  
  图3.血细胞计数器上计数网格的外观，以及用共焦激光扫描显微镜观察PI染色的细胞核
  1. 例如，您可以在网格的角落计算16个方格，包括整个网格的1/9（该面积为1 x 1 x 0.1 mm或0.1μl，并且代表1 ml的1/100）。
  2. 将该区域内发现的细胞核数量乘以10,000，找出总产量（您分离出多少个细胞核）。
    建议：
    1. 来自200个根尖的强的近组成型启动子系（例如35Spro：NTF）的典型产量为150,000-230,000个核。
    2. 检查/计数总核数的起始数（使用来自步骤A7c的细胞核），如果您对显微镜下原始细胞核的分离和细胞核的外观有疑虑的话。
  3. 可选计算：通过使用非转基因组织（'阴性对照'）和与组成型启动子（'35S-IN'）相比较，使用原子核中拉出的细胞核和总原子核数目（P1000 ）：
    效率:( 35S-IN珠 - 背景）/（35S-IN颗粒）
    背景：（35S-IN珠）×（阴性对照珠）/（阴性对照颗粒）＆nbsp;
核糖核苷酸和ATAC的等分。
注意：除了RNA-Seq之外，只有在使用分离的细胞核进行ATAC-seq实验（由Bajic等人，2018详细描述）时，样品的分裂才是相关的。
1. 计算您需要从最终的20μl中获得多少μl的核，以获得50,000个ATAC核。将它们吸到冰上的PCR条上并开始ATAC方案而不冻结（Bajic et al。，2018）。
2. 立即使用RNA的其余部分进行RNA，或在-80°C下冷冻以备后续RNA工作。

数据分析

上述方案需要与其他下游方案（RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP-Seq，qRT-PCT）结合以产生待分析的数据。

食谱

10 N NaOH
向80ml dH 2 O中缓慢加入40g氢氧化钠颗粒，同时不断搅拌。
0.5 M MOPS pH 7

20.93克MOPS在200毫升去离子水中
用10N NaOH（或NaOH颗粒）调节pH至7.0 过滤器通过0.22微米过滤器消毒，等分40毫升等分50毫升猎鹰管，并存储在-20°C
1 M NaCl

在200毫升去离子水中含11.688克NaCl 高压灭菌器，在室温下储存
2 M KCl

29.8205克氯化钾溶于200毫升去离子水中高压灭菌器，在室温下储存
0.5 M EDTA

在200毫升去离子水中的29.224克EDTA 用固体NaOH（> 8g）调节pH至8.0 注意：在pH值调整之前，EDTA不溶解。
高压灭菌器，在室温下储存
0.5米EGTA

19.0175克EGTA溶于100毫升去离子水中用固体NaOH（约4克）调整pH8.0。
注意：EGTA不会溶解，直到pH值调整完毕。
高压灭菌器，在室温下储存
0.2 M精胺
1克在24.7毫升去离子水中
过滤器通过0.22μm过滤器消毒，分装，并在-20°C冷冻。
0.2 M亚精胺
1克在34.4毫升去离子水中。
过滤器通过0.22μm过滤器消毒，分装，并在-20°C冷冻。
10％Triton X-100
5毫升Triton X-100

45毫升无核酸酶水保持室温
核纯化缓冲液（NPB）基地
NPB基质可以通过0.22μm的过滤器过滤灭菌，并保持在4℃达3个月。每个样品通常需要60ml的NPB碱基。
20 mM MOPS（pH 7）
40 mM NaCl
90 mM KCl
2 mM EDTA
0.5 mM EGTA
对于60毫升（一个样品）：
2.4毫升0.5 M MOPS
2.4毫升1 M NaCl
2.7毫升2 M KCl
240μl0.5M EDTA pH 8
60μl0.5M EGTA pH 8
1 L（〜16个样本）：
40毫升0.5 M MOPS
8毫升5 M NaCl
45毫升2 M KCl
4毫升0.5M EDTA pH 8
1ml 0.5M EGTA pH 8
NPB和NPBt缓冲液

在使用前加入Triton X-100，亚精胺，精胺和完全蛋白酶抑制剂，并保存在冰上或4°C。
碘化丙啶（PI）染色

通过将10毫克PI溶解在1毫升蒸馏水中制备1,000倍浓缩储备溶液
使用蒸馏水1：1,000稀释10μg/ ml PI的1x工作溶液将溶液保存在4°C，用铝箔包裹以防止降解

第二部分：总RNA分离和rRNA降解

材料和试剂

移液器吸头（用于P10，P20，P200，P1000，无核酸酶例如，USA Scientific，目录号：1123-1710，1120-8780,1126-7510）
1.5ml Eppendorf管（无核酸酶，例如Denville Scientific，目录号：C2170）
无RNase的PCR条（例如，美国科学公司，产品目录号：1402-2708）
0.22μm注射器过滤器（如，Merck，产品目录号：SLGP033RB）
在第一部分用INTACT分离的核，或任何其他合适的起始组织。
针对rRNA序列设计的1μMDNA探针库存
注意：请参阅有关如何在过程的第1步中设计这些内容的详细说明。
RNeasy Micro Kit（QIAGEN，目录号：74004）或RNeasy Micro Plus Kit（QIAGEN，目录号：74034）
注意：这两个套件都包含所需的组件，但通常一个套件比另一套更便宜。
70％乙醇
无RNase水
Turbo DNA酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2238）
Agencourt RNAClean XP珠（Beckman Coulter，目录号：A66514）
或者：使用AMPureXP珠（Beckman Coulter，目录号：A63881）。
杂交酶耐热RNA酶H（Epicentre，目录号：H39500）
Tris碱（例如，Fisher Scientific，目录号：BP154-1）
盐酸（HCl，例如，Sigma-Aldrich，目录号：435570）
氯化钠（NaCl）（例如，Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化镁（MgCl 2）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
5倍杂交缓冲液H1（见食谱）
10x Hybridase缓冲液H2（见食谱）

设备

移液器（P20，P200，P1000;例如Eppendorf，产品目录号：3123000039,312000055,3123000063）
Dynamag TM-2 Magnet（Thermo Fisher Scientific，型号：Dynamag TM -2，目录号：12321D），或者这个的自制版本。
用于PCR条带的磁性架（，Edge BioSystems，产品目录号：57624）
微量离心机（例如，Eppendorf，目录号：5424系列）
PCR仪（例如，Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：2720）。
NanoDrop分光光度计（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000） >

软件

序列分析软件：SnapGene，Geneious，等

程序

图4提供了该协议的概述，包括所有可能的停止点和温度（理论上，您可以在这些点停留多达几周）。

图4.总结第二部分中的步骤的流程图：总RNA分离和rRNA降解

设计针对rRNA序列的DNA探针
1. 设计针对rRNA序列的DNA探针是此过程的关键部分，因为这是您针对RNA降解的方法。为了靶向核rRNA，您需要获得5S，5.8S，18S和25S rRNA及其内部和外部转录间隔子的序列。如果您打算对总细胞RNA进行rRNA降解，请记住也针对线粒体和质体rRNA。对于许多物种，这些序列可以从 https://www.ncbi.nlm.nih。 gov / nucleotide / 。
2. 设计您的探针长度为60 bp，覆盖整个rRNA的长度（包括间隔区，因为它们将存在于核rRNA中），并反向补充rRNA序列。任何能够将序列转换成反向互补的序列分析软件（SnapGene，Geneious，等等）都可以使用。
3. 订购你的探针（DNA寡核苷酸）作为预先制成的混合物在1000纳升水10 nmol。这是您的10μM库存。
4. 将您的股票10x稀释成工作混合物，其中每个探针的浓度均为1μM。
QIAGEN RNeasy Micro Kit通过使用INTACT分离的细胞核进行总RNA分离
如下使用QIAGEN RNeasy Micro Kit纯化核RNA：
1. 首先向20μl纯化的核中加入350μl裂解缓冲液RLT（加入10μlβ-巯基乙醇/ 1ml）。剧烈漩涡2分钟。
2. 在室温下将溶解产物在1,000xg（3,100rpm）离心2分钟以沉淀珠子。将管置于Dynamag TM TM-2磁体上，并将上清液转移到新的1.5ml管中。加入350μl70％乙醇并涡旋数次混匀。
3. 将溶胞产物/乙醇混合物移入放置在2ml收集管中的RNeasy MinElute离心柱中，并在室温下以10,000xg（9,700rpm）离心1分钟。丢弃流量。
4. 将350μl缓冲液RW1加入色谱柱。在室温以10,000 em x g（9,700 rpm）离心1分钟。丢弃流通并将色谱柱移至新的2 ml收集管。
5. 添加500μL缓冲RPE的列。在室温以10,000 em x g（9,700 rpm）离心1分钟。丢弃流量。
6. 向柱中加入500μl80％乙醇。在室温以10,000 em x g（9,700 rpm）离心1分钟。丢弃流通并将色谱柱移至新的2 ml收集管。
7. 打开柱盖并在室温下以最高速度离心（16,000×g克）5分钟。丢弃流通液并将色谱柱放入新的1.5 ml管中。
8. 向柱膜上加20μl无RNase的水，静置1分钟。
  在16,000×g g离心1分钟
9. 将RNA保存在-80°C。
DNA酶I治疗以消除基因组DNA污染
使用DNase I协议用于Turbo DNase I，如下所示：
1. 加入20μl的RNA：
  2μl10x DNA酶I反应缓冲液
  1μlDNase I
2. 在37°C孵育30分钟
3. 加入2μlDNase I灭活试剂（加入前充分涡旋）并在室温孵育5分钟（每1分钟涡旋一次）。
4. 旋转（2000×g <5分钟）并将20μl回收到新管中。
使用Agencourt RNAClean XP珠去除DNase缓冲液进行RNA清除
1. 将RNAClean XP珠粒加入1.8倍体积（例如，36μl用于20μlRNA）至反应中。
2. 在室温孵育10分钟。
3. 在磁铁上5分钟。
4. 去除大部分上清液（留下5μl以避免吸取珠子）。
5. 将管置于磁铁上，加入200μl70％乙醇，静置30秒。
6. 去除所有上清液。
7. 重复70％以上的洗涤次数（总共洗两次）。
8. 尽可能多地去除EtOH。
9. 空气干燥磁珠10分钟（直到干燥，见图5）。
10. 加入15μl无RNase的水至第一份干燥珠粒并混匀。
11. 如果你有等分样品，请一起回来。
12. 在室温孵育5分钟。
13. 在磁铁上5分钟。
14. 回收15μl洗脱液。
  
  图5. Agencourt XP珠子的外观。：一种。除去乙醇后，珠粒会出现闪亮和潮湿。 B.准备洗脱的珠子看起来干燥，颗粒较细，颜色通常较浅。
NanoDrop for [RNA]和260/280，以便您知道用于调整探针浓度的RNA浓度。
rRNA探针杂交使DNA探针与rRNA结合
1. 步骤6和步骤7的反应大小需要为6μl+4μl（总共10μl），以使缓冲液对于每一步都是最佳的。在DNase I处理前（步骤8），您可以制备多个反应等分试样并回收。
  成功的RNA-Seq文库已由单一0.1μg反应制成
2. 将以下内容加在一起：
  3.8微升RNA（如果这将超过1微克RNA，弥补无RNase水）
  1.2μl5x杂交缓冲液H1（配方1）
  1.0μl探针混合物 - 选择您的浓度如下：
  1. 如果您的RNA量为1μg，则使用1μM/寡核苷酸探针混合物。
  2. 如果您的RNA量为0.1μg，则将探针稀释至0.1μM/ oligo。
    注意：这是我们实验中最常见的探针浓度。
  3. 如果您的RNA量为0.01μg，则将探针稀释至0.01μM/ oligo。
  4. 如果您的RNA量在NanoDrop检测范围内，请使用0.01μM/ oligo。
3. 在PCR仪器中孵育如下：
  95°C 2分钟
  
  以0.1°C /秒降至45°C 45°C 5分钟
  
  保持在45°C
杂交酶（热稳定RNA酶H）反应以消化来自RNA：DNA杂合体的RNA
1. 准备一个预混到45°C（在热块中）的主混合物：
  1μl10x Hybridase缓冲液H2（方案2）
  1μl杂交酶（5 U /μl）
  2μl无核酸酶水
2. 在45°C条件下，将4μl的MM加入到杂交反应中（保留在PCR仪中）。
3. 在45°C孵育30分钟
4. 去冰。
DNase I处理从RNA池中消化DNA寡核苷酸/探针
1. 为DNase I使用DNase I协议。
2. 加入40μlRNA（四份合并）：
  4μl的10x DNase I反应缓冲液
  2μlDNase I
3. 在37°C孵育30分钟
4. 加入2μlDNase I灭活试剂（加入前充分涡旋）并在室温孵育5分钟（每1分钟涡旋）。添加的灭活试剂的最小体积是2μl，因此甚至更小的体积（例如10μl）加入2μl。
5. 旋转（2,000 em x g <5分钟）并将43μl回收到新的试管中。
使用Agencourt RNAClean XP珠子进行RNA清除
1. 将RNAClean XP珠的1.8倍体积（例如，77.4μl用于43μlRNA）添加到rxn。
2. 在室温孵育10分钟。
3. 在磁铁上5分钟。
4. 去除大部分上清液（留下5μl以避免提起珠子）。
5. 将管置于磁铁上，加入200μl70％乙醇，静置30秒。
6. 去除所有上清液。
7. 重复70％以上的洗涤次数（总共洗两次）。
8. 尽可能多地去除EtOH。
9. 空气干磁珠10分钟（直到干燥，见图5）。
10. 向第一份等分试样干珠中加入10μl不含RNase的水并混合。
11. 如果你有等分样品，请一起回来。
12. 在室温孵育5分钟。
13. 在磁铁上5分钟。
14. 回收10μl洗脱液。将RNA保存在-80°C。
注意：洗脱液含有无rRNA的RNA。这适用于RNA-Seq文库构建，但请记住跳过任何polyA富集步骤。我们使用的RNA-Seq文库方案（Reynoso等，2018）是Townsley等人描述的非链特异性随机引物文库。（2015）。

数据分析

上述协议需要与其他下游协议（RNA-Seq）相结合以生成待分析的数据。

食谱

5x杂交缓冲液H1（无RNase）
0.5 M Tris
1 M NaCl
用HCl调节pH至7.0
通过0.22μm过滤器过滤消毒，等分至1 ml等分试样，并储存于-20°C。
10x Hybridase缓冲液H2（无RNase）
500 mM Tris
1 M NaCl
200mM MgCl 2 2/2 用HCl调节pH至7.4
通过0.22μm过滤器过滤消毒，等分至1 ml等分试样，并储存于-20°C。

致谢

这项工作得到美国国家科学基金会（NSF）植物基因组授权号IOS-1238243对R.B.D.，S.M.B.，N.S.的支持。和J.B.-S.和芬兰文化基金会博士后奖学金（K.K.）。美国国家科学基金会本科生补充研究经历（IOS-1238243）和现场项目（DBI-1461297）分别支持S.C和J.V.。
作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Bailey-Serres，J.（2013）。 Microgenomics：多基因调控层的基因组规模，细胞特异性监测 Annu Rev Plant Bio 64：293-325。
Deal，R.B.和Henikoff，S.（2010）。一种用于组织内单个细胞类型的基因表达和染色质分析的简单方法。 Dev Cell 18（6）：1030-1040。
Deal，R.B.和Henikoff，S.（2011）。在拟南芥中用于细胞类型特异性基因表达和染色质分析的INTACT方法 em>。 Nat Protoc 6（1）：56-68。
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