材料和试剂

的材料

离体制备
1. 35毫米培养皿
2. 1cc塑料注射器
3. 27G½针
电
1. 灌注系统用塑料管
2. 直径0.5毫米的铂丝
3. 直径0.07毫米的尼龙纤维
4. 录音室和平台（如哈佛仪器，型号：RC-27和PH-6D）
5. 硼硅酸盐玻璃微量移液管（100μl）（如VWR，目录号：53432-921）

的试剂

离体制备
1. 氯化钠（NaCl）（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
2. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
3. 氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
4. 氯化镁溶液（MgCl 2 ）（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
5. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
6. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
7. L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
8. 木瓜蛋白酶悬浮液（Worthington Biochemical，目录号：LS003126）
9. 氢氧化钠（NaOH）（10 N）（Fisher Scientific，目录号：S25550）
电
1. 氯化钴（II）（CoCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：60818）
2. 四乙基氯化铵（TEA）（Sigma-Aldrich，目录号：T2265）
3. 4-氨基吡啶（4-AP）（Sigma-Aldrich，目录号：275875）
4. （+） - Tubocurarine chloride（curarine）（Tocris Bioscience，目录号：2820）
5. Picrotoxin（Sigma-Aldrich，目录号：P1675）
6. 葡萄糖酸钾（Kgluconate）（Sigma-Aldrich，目录号：P1847）
7. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
8. 腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（Na 2 ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
9. 氢氧化钾（KOH）（8N）（Sigma-Aldrich，目录号：P4494）
10. 氢氧化铯（CsOH）（H 2 O中50重量％）（Sigma-Aldrich，目录号：232068）
11. D-葡萄糖酸溶液（在H 2 O中49-53重量％）（Sigma-Aldrich，目录号：G1951）

设备

离体制备
1. AA Forceps
2. 细尖镊子
3. 渗透压计（如Wescor，型号：5600）
4. 解剖立体显微镜（如尼康仪器，型号：SMZ800N）
5. 鹅颈光源（如Edmund Optics，型号：Fiber-Lite ®照明系统，目录号：35-277）
电
1. 移液器拉拔器（如NARISHIGE，型号：PC-100）
2. 直立显微镜（如OLYMPUS，型号：BX51WI）
3. 放大器（如Molecular Devices，型号：Axopatch 200B）
4. 数字化仪（如Molecular Devices，型号：Digidata 1500B）
5. 微操纵器（如Sutter Instrument，型号：MP-225）
6. 空气台和法拉第笼（如Sutter仪器，型号：AT-3036）
7. 蠕动泵系统（如Cole-Parmer，目录号：EW-77910-20）
8. （附加）在线解决方案加热器（哈佛设备，型号：SHM-828）
9. （附加）温度控制器（哈佛设备，型号：CL-100）

软件

pClamp软件套件（最低版本9.0）

程序

离体制剂
注意：成人飞行的全脑解剖本节的视频可在Jove上获得（Gu和O'Dowd，2007）。
1. 准备解剖解决方案（见食谱1）。解剖解决方案最好在准备后4-5小时内使用。
2. 将飞行小瓶放在冰上约1分钟麻醉苍蝇（仔细观察 - 只需要很短的时间来减慢苍蝇的速度，冰上的时间太长会杀死苍蝇）。
3. 将一小滴（~60μl）解剖溶液放入35 mm培养皿的盖子中。
4. 使用一对细尖镊子和优势手用翅膀或腿拾取麻醉的苍蝇。
5. 使用非惯用手，使用注射器针头将胸腔固定在培养皿上（不要放入解剖溶液中）。
6. 用优势手取第二针注射器针头并斩断苍蝇。
7. 将手放在显微镜载物台上稳定双手，并将手指靠近针尖。当头部朝上时，用针在非惯用手（针1）中将针的左眼固定。在优势针中使用针（针2），在针头1的内侧做一个垂直切口，从嘴侧延伸到尾侧表面（图1）。
8. 把大脑转180度。使用Needle 1将苍蝇的右眼固定下来，再次使用Needle 2在针头1的内侧做一个垂直切口，从嘴侧延伸到尾侧（图1）。
  
  图1.切割角质层。将每只眼睛向下钉并切掉外部。然后钉住并切掉口器。角质层现在将在三面打开以解剖解决方案。
9. 用针1和针2固定口器，做一个水平切口，延伸飞行头的整个宽度，并将切割边缘一分为二（图1）。
10. 小心地将切割头推入解剖溶液滴，并将计时器设置为5分钟。
11. 翻转飞行头，使嘴侧面在盘子上。用针1将大脑下方的嘴侧角质层底部边缘向下钉，并使用针2打开“尾状角质层的皮瓣”（如图2A）。
12. 现在应该暴露完整的飞脑。仍然使用Needle 1固定延髓角质层，使用Needle 2的背面轻轻地将大脑从头部胶囊中推出（图2B）。
13. 用针1固定结缔组织清洁大脑，用针2轻轻推开大脑。尽可能多地清除结缔组织（图2C）。
14. 整个解剖过程应该不到10分钟。
  
  图2.从角质层去除大脑。 A.将尾状角质层面朝上，使用针1将针头延伸到角质层角质层下方。使用针2的背面像书一样打开尾部角质层。 B.仍然用针1钉住嘴侧角质层的内表面，使用针2的背面将脑部推出头部角质层。 C.清除结缔组织，以干净完整的 Drosophila 脑结束。清洁的大脑用复合显微镜成像，嘴侧朝上。在解剖显微镜下，大脑将看起来呈乳白色，带有明亮的白色结缔组织。
安装飞脑用于电生理学
1. 用外部溶液填充记录室。我们使用腔室和平台装置，允许溶液灌注以及腔室加热（图3）。
  
  图3.记录室和支架。腔室连接到两侧的灌注系统以保持溶液流动。腔室还包含与温度控制器的连接，允许我们将腔室直接加热到大脑周围的温热溶液。大脑支架（在步骤B4中描述）可以保护大脑进行录音。
2. 使用200μl移液管将大脑转移到记录室。请注意，飞鼠脑可能会卡在吸管尖端内部，特别是如果结缔组织没有完全清除掉大脑。
3. 用针轻轻地将大脑推到所需位置。对于我们的大部分实验，我们将大脑的尾部定位在腔室表面，触角凸起朝上。可以根据不同实验的具体需要改变位置。
4. 使用脑托稳定大脑，如图4所示。脑托是在我们的实验室制作的。框架由铂丝制成，尺寸为6 mm x 6 mm。尼龙纤维用超级胶水粘在框架上，每根纤维之间的距离约为0.5-1mm，以适应大脑尺寸的变化（但纤维间的大部分间隔更接近0.5mm）。为了最好地稳定大脑，纤维应该在视神经切片和中央大脑区域之间的交界处穿过大脑（图4）。
  
  图4.安装大脑。 A.大脑支架由弯曲的铂丝制成，水平纤维交叉，间距小于0.5毫米。 B.如图所示定位解剖后的大脑并用铂金支架固定。
全细胞记录
我们的探头位于我们的钻机设置右侧，我们使用硼硅酸盐玻璃微量移液管（100μl），它们分两个阶段拉到微量移液器拉拔器上：最终尖端电阻为9-10Ω。
1. 使用灌注（蠕动泵）系统循环外部溶液。当它以低速恒定灌注时，不需要外部溶液的氧合作用。没有建立最低速度，但我们的记录室通常保持灌注速度为0.8毫升/分钟，该记录室容纳1-1.5毫升外部溶液。循环速度可以根据实验需要而变化，例如，快速药物施用或温度变化可能需要更快速的灌注。然而，过快的灌注可能会产生电噪声或使大脑冲洗不适。
2. 用内部溶液填充移液管并装载到探头上。施加正压力以保持移液管尖端没有碎屑。
3. 使用操纵器将吸管移到大脑上方并略微向右移动。
4. 局部神经元悬浮在触角叶的神经纤维区域上方。当移液器接近LN时，细胞应从移液管稍微移开（图5）。对于那些希望研究兴奋性神经元的人来说，胆碱能投射神经元（PNs）位于触角叶内侧。该群体的小穗和当前振幅可能非常小。在大脑的背侧，使用该方案也研究了涉及昼夜节律和睡眠的大小腹侧神经元。
  
  图5.定位局部神经元。有利于记录的局部神经元将悬浮在上方，但拴在触角叶的神经纤维膜上，具有光滑的细胞膜，并在接近时稍微移开。这个电路的兴奋神经元，投射神经元（PNs），也显示出来。
5. 释放电池的压力移开，形成千兆欧姆密封。然后闯入牢房进行记录。
  注意：渗透压对于补丁和录音的成功至关重要。如果细胞在没有形成千兆欧姆密封的情况下立即中断，则渗透压差异太大。如果细胞不能从移液管移开或不能被打破，则渗透压差异太小。外部溶液应该比内部溶液大15-20 mOsm L -1 。我们使用蒸汽压力渗透压计来估算，但调整很常见。 3％稀释度使渗透压降低约10 mOsm L -1 。我们建议将内部溶液保存在一个小密封容器中，例如1.5 ml离心管。如果在开放容器中的内部溶液，渗透压可在几小时内急剧变化（20-30 mOsm L -1 ）水蒸发。

数据分析

使用pClamp套件记录和分析跟踪。我们的方案的样品痕迹如下所示（图6-8）。有关数据处理和分析的更多详细信息，请参阅Sun et al。，2012和Schutte et al。，2014。

图6.钠电流。 LN中的钠电流响应去极化电压 - 步骤如图所示。由于钠通道位于过程中，而不是我们记录的细胞体，钠电流不能很好地进行空间夹持，这也是去极化步骤和通道开放之间延迟的原因。在该迹线中，将电池保持在-70mV并施加一系列去极化迹线以激活通道。 -30 mV是第一次激活电流的扫描，其特征在于激活阈值。瞬态电流幅度约为300pA，在这种情况下持续电流幅度约为100pA。突变细胞可具有比野生型细胞更高或更低的激活阈值和/或电流幅度。在刺激步骤结束后，通道失活，这种表型有时在突变细胞中受损。通道激活后可以应用电压扫描来调查通道停用阈值。

图7.诱发射击。 LN中响应于去极化电流步骤的动作电位小穗列，如图所示。在电流钳中，人们可以研究神经元的诱发射击特性，包括小穗振幅和小穗频率作为刺激强度的函数。这种野生型神经元响应30 pA刺激发射了18个小穗。与对照细胞中的频率相比，突变神经元中更高或更低的小穗频率分别表明高兴奋性或低兴奋性。振幅峰值小于其他生物体中的峰值，因为我们从不合适的细胞体内记录，并且在远处的过程中产生动作电位。

图8.自燃和加热方案。随着温度从22°C升高到35°C，对照（A）和突变体（B）LN中的自发放电记录。由于我们的离体制剂，我们可以在不同条件下运行任何方案。由于我们的实验室研究具有温度敏感表型的突变体系，因此在高温下记录对于我们理解通道突变的通道和细胞后果是必不可少的。我们分析的主要跟踪方面是尖峰和突发阈值，频率和持续时间。野生型细胞在升高的温度下表现出增加的烧制（A）。突变体（B）中的持续去极化主要是热敏表型，并且表明钠通道活性的功能获得突变（Schutte 等，，2016）。（附加设备：哈佛设备在线解决方案加热器和哈佛设备温度控制器）

食谱

解剖解决方案
外部溶液920μl（见下面的配方2）
L-半胱氨酸储备溶液（外部溶液中2 mg / ml）80μl
NaOH（1M）5μl
木瓜蛋白酶9 U
加入木瓜蛋白酶后充分涡旋，等待20-30分钟直至溶液清除使用
最好在4小时内使用解剖解决方案
用于电流钳和制作解剖解决方案的外部解决方案
氯化钠122 mM
氯化钾3.0 mM
氯化钙1.8 mM
氯化镁0.8 mM
葡萄糖5.0 mM
HEPES 10 mM
（+） - Tubocurarine20μM
印防己毒素10μM
录制自发射击时，省略PTX和curarine
用NaOH调节pH值7.2并将渗透压调节至250-255 mOsm L -1
外部溶液可在4°C保持一周
电压钳的外部解决方案
氯化钠122 mM
氯化钾3.0 mM
氯化钙1.8 mM
氯化镁0.8 mM
葡萄糖5.0 mM
HEPES 10 mM
四乙基铵（TEA）2.5 mM
4-氨基吡啶（4-AP）1.0mM
（+） - Tubocurarine20μM
印防己毒素10μM
用NaOH调节pH值7.2并将渗透压调节至250-255 mOsm L -1
外部溶液可在4°C保持一周
用于电流钳的内部（移液器）解决方案
葡萄糖酸钾102 mM
氯化钠17 mM
氯化钙0.085 mM
氯化镁1.7 mM
HEPES 8.5 mM
EGTA 0.94 mM
ATP 25 mM（2.5 mg / ml）*
用KOH将pH调节至7.2，并将渗透压调节至232-235 mOsm L -1
可将溶液等分成1-2ml等分试样并在-20℃下储存长达一年
注意：*在实验前，解冻一个等分试样并加入ATP 25 mM（2.5 mg / ml）。
用于电压钳的内部（移液器）解决方案
氢氧化铯102 mM
D-葡萄糖酸102 mM
氯化钠17 mM
氯化钙0.085 mM
氯化镁1.7 mM
HEPES 8.5 mM
EGTA 0.94 mM
ATP 25 mM（2.5 mg / ml）*
用CsOH将pH调节至7.2，并将渗透压调节至232-235 mOsm L -1
可将溶液等分成1-2ml等分试样并在-20℃下储存长达一年
注意：*在实验前，解冻一个等分试样并加入ATP 25 mM（2.5 mg / ml）。

致谢

这项工作得到了NIH Grant NS083009到DKOD和GAANN奖学金P200A120207到AJR的慷慨支持。
作者宣称没有利益冲突。

参考

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