材料和试剂

转移移液器，大口径（Globe Scientific，目录号：135040）
搅拌棒（SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：F37122-0060）＆nbsp;
胰岛素注射器，28号（Fisher Scientific，目录号：14-826-79）
制造商：BD，目录号：329461。
具有微丝的硼硅酸盐毛细管玻璃，1.2 mm x 0.68 mm，4“（A-M系统，目录号：602000）
碳纤维（GoodFellow，目录号：C 005722）
不锈钢导线（L 3,000 x 1,000 s x 1,000 s UL 1423，UL1423 30/1 BLU），带绝缘段（Kauffman Engineering，定制）
铂金线，直径0.5 mm，退火（Alfa Aesar，目录号：43288）
1 mm直径x 4 mm Ag / AgCl参比电极（颗粒形式）（World Precision Instruments，目录号：EP1）
双极刺激电极（Plastics One，目录号：8IMS3033SPCE）
乐泰® 404 TM 瞬干胶（VWR，目录号：300001-033）
制造商：Henkel，Loctite ® 专业超级胶水，目录号：442-46548。
超纯水
去离子水
异氟醚（Patterson Veterinary Supply，目录号：140430704）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
磷酸二氢钠一水合物（H 2 NaO 4 P•H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：S369-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化镁六水合物（MgCl 2 •6H 2 O）（VWR，目录号：BDH9244）
D - （+） - 葡萄糖（C 6 H 12 O 6 ）（西格玛奥德里奇，目录号：G8270）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
L-抗坏血酸（C 6 H 8 O 6 ）（Sigma-Aldrich，目录号：A0278）
盐酸多巴胺（Sigma-Aldrich，目录号：H8502）
高氯酸（HClO 4 ），ACS试剂，60％（Sigma-Aldrich，目录号：311413）
70％乙醇溶液（Fisher Scientific，目录号：BP8201500）
人工脑脊液（ACSF）（见食谱）
10倍克雷布斯原液（见食谱）
1 mM多巴胺原液（见食谱）

设备

100毫升塑料烧杯（Cole-Parmer，目录号：EW-06020-03）
1升塑料瓶（Cole-Parmer，目录号：EW-06058-85）
-20°C冰柜
光源（Fisher Scientific，目录号：12-562-21）
亚克力冠状脑基质（Harvard Apparatus，目录号：62-0047 [适用于大鼠]，62-0050 [适用于小鼠]）
Personna双刃不锈钢剃刀刀片（电子显微镜科学，人格，目录号：72000）
Silver Print II（GC Electronics，目录号：22-023）
剪刀（Harvard Apparatus，目录号：72-8422）
Bone Rongeurs（Harvard Apparatus，目录号：72-8906）＆nbsp;
Spoonula TM Lab Spoon（Fisher Scientific，目录号：14-375-10）
镊子（Fisher Scientific，目录号：10-300）
Scalpel（Harvard Apparatus，目录号：72-8350）＆nbsp;
13号手术刀片（Harvard Apparatus，目录号：72-8366）
感应室（哈佛仪器，目录号：60-5246）
断头台（哈佛仪器，目录号：73-1918）＆nbsp;
鳄鱼夹（Mueller，目录号：BU-34）＆nbsp;
气体分散管（康宁，目录号：39533-12C）
医用气罐，carbogen（林德）＆nbsp;
气体调节器（VWR，目录号：55850-444）
搅拌器（Thermo Fisher Scientific，目录号：HP88857100）
立式微电极拉拔器（NARISHIGE，目录号：PE-22）
房子真空线
半自动振动刀片切片机（徕卡显微系统，型号：VT1200 S）
Chem-Clamp恒电位仪（Dagan，目录号：CHEM-5-MEG）
Headstage（5兆欧）（Dagan，目录号：8024）
Breakout Box，定制（访问Pine Research，WaveNeuro Fast-Scan CV恒电位仪，用于PINE研究提供的FSCV捆绑包。许多捆绑选项包括分线盒）
高速模拟输出卡（National Instruments，目录号：PCI-6711）
数据采集卡（National Instruments，目录号：PCIe-6351）
电流刺激隔离器（Digitimer，型号：NL800A）
温度控制器TC-344C（哈佛设备，目录号：64-2401）
蠕动泵P-70（哈佛仪器，目录号：70-7000）
带刻线的立式光学显微镜（适用于Olympus的型号，型号：BX53M和显微镜世界，型号：KR887）
3轴手动微操纵器（NARISHIGE，型号：MM-3）
校准系统，定制（见图5A）
1. Tygon ®油管（Sigma-Aldrich，目录号：Z685666）
  制造商：Saint-Gobain，目录号：AJK00022。
2. 注射器，5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z116866）
3. 注射器，30 ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z683671）
4. 带旋塞阀的T型连接器（Cole-Parmer，目录号：UX-30600-02）
单注射器输液泵（Fisher Scientific，目录号：14-831-200）
通风柜（可选）
灌注室（Custom Scientific，定制订单）
使用Control-A-Flo稳压器设置的Clearlink系统扩展（Baxter，目录号：2C8891）

软件

Demon Voltammetry and Analysis软件套件，可在以下网站免费获得： https://www.wakeforestinnovations.com/technologies/demon-voltammetry-and-analysis-software/
注意：必须提交许可证申请才能下载。

程序

在实验日之前

碳纤维电极制备（图1）
1. 使用室内真空管线，将单根碳纤维（约12厘米长）吸入毛细管（图1A-1D）。用手指按住碳纤维的一端，以防止它被吸入真空管线（图1C）。
  注意：在一张白纸上分离碳纤维有助于可视化单根纤维，因为重要的是只将一根碳纤维吸入毛细管中。
2. 将填充碳纤维的毛细管装入垂直微电极拉拔器，中点位于加热元件的中心（图1E）。从单个毛细管中拉出两个电极后，用剪刀剪断连接两半的碳纤维（图1F）。
  注意：
  1. 在拉动前用永久性标记将玻璃毛细管标记在其中点可能会有所帮助。标记的中点位于加热元件的中心，从而形成两个等长的碳纤维电极。
  2. 微电极拉拔器的设置因实验室而异。我们的实验室使用以下设置：89.1主磁铁; 20.9子磁铁; 54.2加热器。理想的设置允许拉出的玻璃与尖端处的碳纤维紧密融合，同时足够坚固以抵抗玻璃 - 碳纤维界面附近的开裂（通常设置产生约0.75cm的锥形长度是最佳的）。可能需要进行试验和错误测试，以确定各个拉拔器的最佳设置。
3. 在具有10倍放大率的光罩的光学显微镜下（图1G-1K），使用手术刀将碳纤维电极尖端处的碳纤维修剪至所需长度。
  注意：我们的实验室使用的碳纤维尖端长度约为30-100μm。实验室之间的最佳长度可能会有所不同，具体取决于各个设置的灵敏度。
4. 在不锈钢导电线上涂一层Silver Print II，并将其穿入碳纤维电极（图1L-1N）。在使用前，让油漆在敞开的通风区域（如通风橱）中干燥至少12小时（图1O）。
图1.碳纤维电极（CFEs）的生产。 A.切割一束碳纤维，使其长度略长于毛细管。 B.标记毛细管的中心点有助于放入重力电极拉拔器（见图1E）。 C.戴上手套时，隔离单根碳纤维，用手指轻轻地约住光纤的一端。 D.在室内真空管（蓝色箭头）上粘贴毛细管，并且在保持碳纤维的一端的同时，将碳纤维的另一端（黑色箭头）吸入毛细管中。 E.将含有单根碳纤维的毛细管装入重力电极拉拔器，并将毛细管的中心点定位在加热元件中（红色箭头）。 F.完成电极牵引后，用剪刀剪断连接两个电极（蓝色箭头）的碳纤维（黑色箭头），以产生两个CFE。 G.使用带有标线和10倍物镜的光学显微镜，将CFE放在载玻片上，使尖端接触载玻片（可以使用一小块腻子将CFE固定在正确的位置）。 H.使用手术刀刀片将碳纤维切割成合适的长度。 I.未切割的CFE显示在10x目标下。玻璃和碳纤维之间的界面显示在绿色箭头处。 J.使用手术刀刀片将CFE切割成适当的长度（30-100μm）。确保剃刀刀片的尖端靠在载玻片上并在显微镜中可见以便更精确地切割是非常有帮助的（粉红色箭头表示刀尖）。 K. CFE在切割碳纤维后显示，显示为绿色箭头指示的玻璃界面。 L-N。将涂有Silver Print II的不锈钢导线插入CFE中。 L.不锈钢丝（蓝色箭头）和切割CFE（黑色箭头）。 M.在Silver Print II中涂上电线和蓝色绝缘层的一端。 N.将电线插入CFE。 O.完成的CFE应放在通风橱中，在使用前至少干燥12小时;如图所示，存放在带有泡沫的塑料盒中以固定CFE。
其他准备工作
1. ACSF和Krebs溶液的制备
  1. 准备10x Krebs溶液（参见配方）并在搅拌板（带搅拌棒）上搅拌直至所有溶质溶解（至少1小时）。
    注意：我们的实验室生产1升Krebs原液，在4°C下保存最长1个月。
  2. 在实验当天，准备500毫升ACSF。将75毫升ACSF倒入150毫升塑料烧杯中，并将250毫升ASCF倒入500毫升塑料瓶中。将塑料烧杯和瓶子放入-20°C冰箱中。 ACSF的这个冰冻部分将在冰冷的温度下保持实验当天使用的ACSF（在寒冷的温度下切片可以改善组织的健康状况）。
    注意：在切片当天，将制备新鲜的ACSF并将其加入含有冷冻ACSF的塑料瓶中进行氧化并用于切片（如下所述）。切片后，将瓶子和烧杯一半放回冷冻室进行后续实验。

实验日

设置
1. 准备新鲜的ACSF溶液并等分至下面提到的近似体积：
2. 通过打开碳氢化合物罐的气体调节器，氧化物制备ACSF（上面列出的a-c），并将气体分散管放入每个容器中。氧气应该连续流动，并且应该观察到稳定的气泡流。
  注意：注意不要过度含氧，否则会出现剧烈或滚动的气泡。
3. 将振动切片机和脑基质（图1A）置于-20°C的冰箱中，并在振动切片机中加入新鲜刀片;设定厚度和切片速度（鼠标速度0.46毫米/秒，厚度300微米;鼠标速度0.60毫米/秒，厚度400微米）。
4. 通过添加去离子水填充记录盘的底部来准备FSCV装置。
  注意：确保水覆盖加热器线圈以防止管道熔化。
5. 通过使用蠕动泵或具有Control-A-Flo调节器的重力流，将气体氧化的ACSF从气缸1b以1ml / min流入切片孔。
6. 打开以下设备：（1）温度控制器TC-344C，在记录盘中设定为32°C; （2）电流激励隔离器，输出设定为1 mA; （3）Chem-Clamp; （4）光源，和（5）显微镜（图3A-3B中可视化）。
7. 使用注射器从记录盘的流出管中抽取液体，这将允许液体开始流出培养皿并进入废液瓶。
  注意：在整个实验过程中，需要保持流出量。对于新的管道，这可能会特别麻烦，这可能需要在一天内多次重新建立流出量。
8. 在脑提取之前，将约50ml冷的含氧ACSF从瓶1a加入含有冷冻ACSF的圆筒1b中。这将用于将大脑运送到vibratome。
脑提取（有关详细信息，请参阅Papouin和Haydon [2018]）
1. 将异氟醚加入诱导室，让气体在整个室内分配（小鼠2-3分钟，大鼠5-10分钟）。
2. 在诱导室中深度麻醉啮齿动物，然后立即斩首。
  注意：在斩首前确保动物仍在呼吸（沮丧的速度）是很重要的。在我们的实验室中，大鼠和小鼠斩首通过断头台进行。
3. 用剪刀做中线切口（尾端到头端），露出颅骨;横向拉皮肤，以显示头骨的缝合线。
4. 使用咬骨钳（用于老鼠）或小剪刀（用于老鼠）小心地移除头骨以暴露大脑的背面。
5. 剥离表面血管和脑膜。
6. 小心地在大脑下面用一把刮刀将其从任何颅神经中解放出来。
7. 一旦释放，将大脑完全浸没在含有冷冻和新鲜ACSF的圆筒1b中。
脑切片
1. 使用镊子将大脑从圆柱体1b转移到大脑基质，将大脑腹侧向上排列。使用塑料移液器将冷却的含氧ACSF（约2 ml）转移到脑基质中。
  注意：在此步骤中，大脑不必完全淹没。将ACSF加入到基质中的大脑中将有助于矫正大脑并防止其粘附在基质表面上。
2. 仍然用纸覆盖，将Personna双刃刀片卡入两个单刃刀片中。＆nbsp;
3. 将单个边缘刀片放置在基质中的所需位置以去除多余的脑组织（以下称为阻塞）（图2A）。
  注意：当我们的小组分离含有伏隔核的切片时，我们在后脑水平上尾部阻塞以移除小脑，并且阻断腋下以去除嗅球和早期前额叶皮层。注意不要挡住过多的组织，保留所需的感兴趣区域。
4. 将少量（约一滴）Loctite ® 404 TM 胶水放在舞台上，并使用镊子将大脑从基质转移到舞台上。快速将大脑的尾侧放在胶水上（图2B）。
  注意：注意不要使用过多的胶水。过量使用胶水会导致大脑在添加ACSF时从舞台上脱落，这将导致切片条件不佳。
5. 小心地将单刃刀片向下推到中线（背侧到腹侧）以使大脑半切。
6. 将舞台放在振动切片机上，并用冰冷的含氧ACSF（从1a瓶中）填充舞台以淹没大脑。
  注意：避免将ACSF直接倒在大脑上，因为这可能导致大脑从舞台上脱落。
7. 将刀片降低到ACSF溶液中，并将切片窗口设置为超出大脑背侧和腹侧末端至少1 mm;按照上面列出的建议设置切片大脑。
8. 使用转移移液管或刮刀将切片转移到记录皿的切片孔中（图2C）。
  注意：额外的切片可以存储在存储烧杯中（图2F），最长可达6小时。该储存烧杯应填充ACSF，通过气体分散管连续供氧。如果需要将切片从存储烧杯转移到切片孔（在记录盘中），则使用如上所述的步骤C8。请参考Papouin和Haydon，（2018）创建储存烧杯（巢烧杯）。
  
  图2.脑切片（显示小鼠）。 A.使用大脑矩阵，使用单刃刀片在适当的嘴侧（红色箭头）和尾侧（蓝色箭头）位置阻挡大脑。 B.将大脑的头侧坚持到舞台上，半切除，并将大脑浸入冷的，充氧的ACSF中。 C.使用刮刀或转移移液管（未示出），小心地将脑切片转移到记录盘（紫色伏隔核（NAc））。 D.使用铂重物固定脑切片，放置在远离感兴趣区域的位置。 E.将双极刺激电极和碳纤维电极放置在感兴趣的区域（显示NAc）。 F.含有氧化ACSF的储存烧杯图，带有网状孔以保留切片（O 2 是指通过气体分散管流入烧杯的碳水化合物）。＆nbsp;
设置FSCV设备
1. 为了减轻脑切片的压力，将铂丝放在远离记录位置的切片边缘（图2D）。
  注意：FSCV的典型设备设置如图3所示。
2. 将盖子放在记录盘上，并将Ag / AgCl参比电极颗粒完全浸入ACSF溶液中。使用鳄鱼夹将参比电极和碳纤维电极连接到探头（图3D）。
3. 在开始实验之前，使用胰岛素注射器28 Gauge小心地去除在切片孔网下形成的任何气泡。
  注意：如果它们影响信号，可能需要在实验过程中去除气泡（见注6）。
  
  图3.快速扫描循环伏安设备的设置。 A.典型的FSCV设置（称为FSCV设备）。 B.替代典型的FSCV设置。 C.记录盘的近视图，没有盖子。 D.带盖的记录盘，切片中的脑片，刺激电极和碳纤维电极就位。 E.放大器（Chem-clamp）和数字转换器（Breakout Box）设置。 F.刺激发生器（Neurolog）显示来自Breakout盒的输入并输出到双极刺激电极。
用于测量多巴胺的软件设置（恶魔伏安法和分析）
1. 单击编辑CV和Stim ，这将允许设置命令电压和刺激设置。
2. 设置参数后，单击应用。标准设置如（图4）所示。
  
  图4.用于多巴胺检测的恶魔伏安法设置 A.用户界面显示典型的实验设置，其中包含来自电极的理想电流 - 电压图（红色框）。对于碳纤维电极调节， CV freq （蓝色框）可以从10 Hz增加到60 Hz。 B.命令电压设置。可根据需要调整开关电位（红框;见注4）。 C.单脉冲实验的刺激设置（频率不用于单脉冲）。频率和脉冲数（红色框）可根据需要进行多脉冲实验调整（见注5）。
电极调节（仅适用于新电极）
1. 使用显微操纵器，降低碳纤维电极，将碳纤维尖端浸入ACSF（不要将碳纤维电极降低到大脑中）。＆nbsp;
2. 打开＆nbsp; C V ，然后以60 Hz的频率反复扫描至少20分钟。＆nbsp;
3. 完成上述调节步骤后，关闭 CV 并将频率更改为10 Hz（FSCV的工作循环伏安频率）。
  注意：电极可以使用2-4次，只有在第一次使用时才需要这个调节步骤。如果电极不是新的，则从10 Hz的工作循环伏安频率开始，并跳过收集多巴胺信号。调节步骤可以更快地稳定新电极。
收集多巴胺信号
1. 使用显微操纵器，将碳纤维电极降低约75μm（视觉估计）到感兴趣的脑区域。
2. 将双极刺激电极（使用显微操纵器）降低到距离碳纤维电极100-200μm的切片表面（图1E）。
  注意：一个常见的早期错误是在降低刺激电极时刺破切片表面。缓慢降低刺激电极直到切片表面凹陷是有帮助的。当发生凹陷效应时，略微抬高刺激电极以确保它位于切片表面的顶部。
3. 命名集合文件并设置保存文件夹。
4. 将集合文件数设置为1，并取消选中“等待”按钮。此步骤的文件名可以设置为“默认”，或者重命名。＆nbsp;
  1. 可能需要一些电极放置以获得最佳信号（如图4所示）。
  2. 当试图获得最佳信号时，切片健康状况更好地移动碳纤维电极而不是刺激电极（由于尺寸，可能会损坏组织）。
5. 一旦获得合理的多巴胺信号（对于大鼠切片最佳地大于3nA并且对于小鼠切片大于7nA;图5），设置期望数量的收集文件。将采集间隔设置为180秒（对于单脉冲实验）或300秒（对于多脉冲实验）。＆nbsp;
6. 单击收集按钮开始收集多巴胺信号
  
  图5.理想的多巴胺信号。 A.在Demon收集窗口中观察到的受刺激多巴胺的理想信号。 B和C.恶魔分析窗口中的相同信号，显示（B）多巴胺信号（循环伏安图插图显示氧化和还原峰），和（C）相关颜色图，显示氧化峰（蓝色箭头）和还原峰（黑箭头）多巴胺。
1. 收集基线信号30-40分钟后停止采集（至少10个采集间隔180秒的采集或至少8个采集间隔300秒的采集）。＆nbsp;
2. 单击分析按钮，检查最后三个信号以查看集合是否已稳定（集合之间的幅度变化小于10％，而不是全部增加或减少。例如，如果最后三个集合具有幅度为9.8 nA，10.2 nA和10.5 nA，多巴胺信号不稳定。如果收集量为9.8 nA，10.2 nA和9.7 nA，信号稳定，实验者可以继续进行步骤G7）。 br /> 注意：不要让切片在选定的刺激间隔内没有定期刺激，否则信号需要重新稳定。
3. 稳定后，可将目标药理学试剂加入ACSF圆筒中。更改集合名称，并收集最少30分钟，以使药剂达到最大效果。
  注意：可以累积剂量添加药物，以产生浓度 - 反应曲线。一旦曲线以所需浓度完成，实验就结束了，切片不再可用于其他实验。
4. 完成实验后，请关闭 CV 按钮。＆nbsp;
5. 从探头上断开碳纤维电极和刺激电极。
6. 将碳纤维电极移至校准系统以确定电极对多巴胺的敏感性。
  注意：最佳做法是在每个实验结束时或在将电极用于其他实验之前进行校准。即使将相同的电极用于两个实验，对多巴胺的敏感性也会因电极结垢而改变。
碳纤维电极的校准（图6）
1. 将ACSF中的多巴胺稀释至已知浓度的多巴胺（我们的实验室使用3μM），并用稀释的多巴胺溶液填充5 ml注射器。＆nbsp;
2. 在30 ml注射器中注入ACSF溶液，然后将其放在一个注射器输液泵上。＆nbsp;
3. 打开Demon Voltammetry软件并使用与上面列出的相同设置，但将收集间隔更改为0秒，将文件数更改为5。
4. 将碳纤维电极和参比电极重新连接到与执行实验相同的探头。＆nbsp;
5. 使用单个注射器输液泵通过校准系统运行ACSF，并将碳纤维电极降低到ACSF溶液中（图6A）。
6. 打开 CV 按钮（电极信号形状应与实验期间相同），然后开始收集。＆nbsp;
7. 让ACSF流动5秒钟，然后在接下来的5秒内施加一致的稀释多巴胺溶液流，然后使用ACSF溶液。继续每个额外的收集。
  注意：多巴胺信号应具有近似方形的峰（图6B）。
8. 分析校准集合以确保多巴胺信号稳定（不在一个方向上趋势）。如果多巴胺电流持续增加或减少，重复步骤H6以收集额外的校准数据。＆nbsp;
9. 一旦多巴胺信号稳定，就收集平均所有多巴胺电流（nA）。将平均电流除以用于校准的多巴胺溶液浓度（3μM），以确定校准因子（nA /μM）。
  注意：如果任何收集幅度与其他收藏品有很大差异，请将其排除并相应地平均。
图6.电极校准。 A.电极校准系统。泵用于通过带有旋塞阀的T形连接器（蓝色箭头）驱动ACSF。电极下降到ACSF液滴（红色箭头），电极和参考线（黑色箭头）连接到探头。 B.理想的校准曲线，显示具有快速动力学的方形形状。 C.从过度使用的“慢”电极获得的非理想校准曲线。在重复使用后，脂质和蛋白质可粘附并污染碳纤维的表面。这减缓了多巴胺检测的动力学，导致倾斜而不是方形校准曲线（红色箭头表示减慢动力学的区域）。
清理
1. 使70％乙醇溶液以增加的流速（例如，2ml / min）流过每个记录盘10分钟。用3％过氧化氢重复，然后用蒸馏水重复。
2. 如果使用蠕动泵，允许空气流过管道，直到所有液体都从管道中移出。如果使用重力流量系统，将Control-A-Flo调节器设置为“灌注”功能，并使用注射器将空气推入管道以清除任何残留液体。
3. 将使用过的ACSF倒入适当的废物容器中。

数据分析

使用Michaelis-Menten建模进行恶魔伏安法分析（参见Yorgason et al。，2011）
注意：此程序描述了Michaelis-Menten曲线拟合分析技术。然而，可以通过Demon Voltammetry and Analysis程序分析许多动力学参数。请参阅Yorgason等人。（2011）进行彻底审查。
1. 打开程序，然后单击分析。
2. 单击打开文件按钮以允许用户选择感兴趣的文件。
3. 单击动力学，然后输入实验的计算校准因子（nA /μM）。
4. 转到基线校正选项卡，将开始（绿色）线和结束（红色）线移动到收集信号的开头。点击重置，然后点击 Pre Stim Shift 。现在，基线偏移应显示为0.00。
5. 转到峰值和衰减标签。将Pre（绿色）线定位在多巴胺信号的开始处，信号峰值处的峰（紫色）线和多巴胺信号末端的柱（红色）线。单击分析，并确保建模（黄色）线适合曲线。单击导出以保存文件（图7A）。出现提示时，相应地命名文件，然后选择保存。保存来自同一实验的后续分析时，您可以选择此文件，然后将所有峰值衰减数据保留在一个文本文件中，以后可以在Excel中以制表符分隔（见下文）。
6. 转到 Michaelis-Menten分析标签。输入160
7. 出现提示时，相应地命名文件（确保从峰值衰减文件中分配名称），然后选择保存。保存来自同一实验的后续分析时，您可以选择此文件，然后将所有建模数据保留在一个文本文件中，以后可以在Excel中以制表符分隔（见下文）。
  
  图7.使用Demon Software进行伏安法分析。 A.峰值衰减分析。 Demon软件会自动尝试拟合这些参数，但可能需要稍微纠正。绿色，紫色和红色线应分别放置在刺激时间点，信号峰值和信号返回基线后的时间点。黄点表示程序的自动峰值衰减拟合。 B. Michaelis-Menten模型拟合，显示恶魔用户界面，用于调整动力学参数以正确拟合信号。
将数据导出到Excel
1. 打开Excel，然后输入包含峰值/衰减或建模数据的 CYE 文件。
  请务必从下拉列表中选择所有文件，以查看 CYE 文件格式。
2. 出现提示时，请确保选择了分隔选项，然后点击下一步。
3. 出现下一个提示时，请确保选择选项卡选项，然后单击完成。
  将生成包含分析实验中所有文件的表格。创建包含研究中所有实验文件的主电子表格会很有帮助。然后可以使用统计软件（例如Prism）分析感兴趣的值。

笔记

电极放置：放置电极时，重要的是保持实验之间的位置一致性。多巴胺信号不仅在感兴趣区域中的位置（例如伏隔核的核心和壳）之间发生变化，而且还沿着背腹侧和尾侧 - 尾侧轴变化。
实验时间：在动物的光暗周期中保持一致的时间对于确保多巴胺水平的时间波动不会混淆任何潜在的发现很重要（Ferris 等。，2013）。在药物后的同一时间点提取大脑也是很重要的，以便始终如一地观察相同的时间定义的药物作用。
多巴胺转运蛋白的竞争性抑制剂：动力学常数“K m ”测量多巴胺对多巴胺转运蛋白的亲和力，并且基于竞争结合分析估计为160 nM （先前已确定; Wightman et al。，1988）。然而，FSCV可用于测量多巴胺转运蛋白（例如可卡因）的竞争性抑制剂对多巴胺再摄取的影响。在这种情况下，使用“表观”K m ，其模拟多巴胺摄取抑制。为了分析已知多巴胺转运蛋白受影响的实验，将K m 设定为160 nM以分析基线曲线，并通过调整V 拟合曲线的下降部分最大。对于存在抑制剂的曲线，将V max 维持在基线迹线中确定的值，并调整K m 。获得的值表示为“表观K m ”，表示常数本身没有变化，但多巴胺对多巴胺转运蛋白的表观亲和力随转运蛋白抑制而变化。请注意，这种调整K m 的技术仅适用于多巴胺转运蛋白靶向药物，对于所有其他实验，K m 应在整个曲线拟合中保持在160 nM分析。
确定适当的切换潜力：在恶魔收集软件中，可以根据需要调整切换潜力。对于多巴胺的测量，开关电位可在1.1 V和1.3 V之间变化。在大多数FSCV实验室（包括我们自己的实验室）中，利用1.2 V的开关电位来提供足够的灵敏度，同时还保持碳纤维电极的完整性。 3-4用法。将开关电位增加到1.3 V可提高电极灵敏度;然而，1.3V的开关电位可能导致电极“漂移”或不断改变灵敏度，因此需要更频繁地更换碳纤维电极。开关电位也可降至1.0或1.1 V，以降低灵敏度。通常，当电极在实验的基线部分期间开始“限制”时，切换电位仅降低（图5C），并且新电极不可用。在改变切换电位时，需要收集新的基线，因为诱发释放的峰值高度（以nA为单位）将通过改变的电极灵敏度而改变。切换电位特定于被分析的物种。在这里，我们描述了多巴胺FSCV的指南。
确定脉冲的频率和数量：频率（Hz）和脉冲数可以根据需要进行更改，通常在检查药物或治疗对“阶段性”刺激动力学的影响时。虽然频率设置对单脉冲实验没有影响，但典型的多脉冲实验包括针对多个增加频率中的每一个施加的设定数量的脉冲（通常为5或10）（即，5 ，10,20,40,60,100赫兹），刺激间隔为300秒（参见Ferris et al。 [2013]进行审查）。
疑难解答
1. 电极（表1）
  
  表1.常见电极并发症和解决方案
2. 碳纤维电极（图8）
  
  图8.常见的碳纤维电极问题。有关故障排除提示，请参阅表1。 A.碳纤维电极接地不正确（正确接地的迹线显示为红色）。 B.碳纤维电极，灵敏度低于最佳值。请注意红色箭头指示的相对扁平的形状。 C.限制（过于敏感）碳纤维电极。电极电流超过计算机接口的最大限制，导致数据丢失。请注意，红色箭头处的全电流范围已被切除。 D和E.刺激物神经元与信号分离（注意，由于存在3μM可卡因洗涤切片，衰变动力学看起来很慢）。 D）用彩色图插图描绘y轴上的电压，x轴上的时间和z轴上热图形式的电流;参见Yorgason 等人（2011）（红色和白色箭头分别表示在I / T图和颜色图上的尖峰存在的视觉指示）。 E）迹线的点图表示，红色箭头表示存在噪声尖峰。 F.刺激器伪影未与具有颜色图和循环伏安图插入的信号分离（红色和白色箭头分别表示在I / T图和颜色图上的尖峰存在的视觉指示）。注意，循环伏安图中的多巴胺峰值（~7 nA）与迹线中的表观峰值（~19 nA）不对应，这是潜在干扰刺激物伪影的另一个指示。 G.带有彩色图插图的宽基线信号。
3. 噪声：信号噪声增加通常是由以下问题之一引起的：电极中的噪声（见上文），实验者的静电，碟中的气泡或外部电噪声的干扰（所以称为60赫兹噪音）。如前所述，可以替换“噪声”电极。为了防止实验者产生静电，最好在接触微操纵器或其他钻机部件之前接触接地的法拉第笼。这将消除由于该地区的衣服或一般电力而可能发生的任何潜在的静电积聚。盘子里的气泡也会导致噪音。在这种情况下，可以如前所述去除气泡本身。还可以安装气泡捕集器以降低到达培养皿的管道中的气泡频率。来自外部电噪声的干扰是信号中自发噪声的最常见原因。电噪声的起源可能难以确定，并且经常在没有警告的情况下产生;但是，可以采取预防措施来改善自发噪音。例如，干燥的空气会增加静电，从而增加噪音，但在干燥天使用加湿器可以减轻噪音。其他故障排除选项包括完全封闭法拉第笼，确保钻机表面没有安装过程中使用的所有工具，如镊子和注射器，以及关闭钻机中的灯。通常，蠕动泵和伏安设备等电子设备必须保持在法拉第笼外，以尽可能减少这些设备的噪音。
4. 常见电极放置错误（图9）
  
  图9.理想的电极放置。该图像改编自图1D。上图表示碳纤维电极和双极刺激电极（Stim）对FSCV的理想定位。答：碳纤维电极应放入脑片大约75微米;放置太深或太浅会产生低于最佳的多巴胺反应。碳纤维电极也应在两根刺激线之间的中心进行三角测量。 B.刺激电极应该只接触大脑表面;放置在组织太深的位置会导致FSCV信号不良和组织损伤。刺激电极的两根导线应平放在组织上;弯曲的刺激电极可导致刺激伪影的增加（参见图5D）。 C.刺激电极和碳纤维电极应放置在约100-200微米的距离;放置太靠近在一起会增加伪影的发生，而放置太远则可能导致多巴胺信号减少。

食谱

人工脑脊液（ACSF）
10倍Krebs库存解决方案

注意：＆nbsp;
1. 10x Krebs Stock Solution用于制备人工脑脊液（ACSF）。
2. 一种10倍Krebs原液，含有上述大部分溶质（NaHCO 3 ，抗坏血酸和D-葡萄糖）预先制备。
1 mM多巴胺原液

在每天的实验中，制备3μM多巴胺溶液，用于校准。例如，将150μl多巴胺原液加入50 ml ACSF中。

致谢

该研究得到了美国国立卫生研究院的资助P50 DA006634，R01 DA014030，T32 DA041329，U01 AA014091，P50 AA12298125和R01 AA023999。 Demon Voltammetry and Analysis软件套件由Jordan Yorgason和RodrigoEspaña在Jones实验室编写。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

实验方案遵循美国国立卫生研究院动物护理指南，并获得了维克森林大学机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

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