材料和试剂

1-200μl移液管吸头（无DNA酶）（康宁，美国）
0.2-2μl移液管吸头（不含DNase）（康宁，美国）
100-1,000μl移液管吸头（无DNA酶）（康宁，美国）
剃刀刀片（任何标准品）
1.5ml和2ml微量离心管（不含DNA酶）（Corning，USA）
15ml和50ml离心管（不含DNA酶）（Corning，USA）
铝箔（任何标准品）
玻璃幻灯片（任何标准品）
封面（任何标准品）
1-4周龄的水稻（“Oryza sativa”）IR64）幼苗（见“程序”部分开头的注释）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24102）
注意：本产品已停产。
ProLong ®使用DAPI的金防晕装置（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P36931）
DeadEnd TM 荧光TUNEL系统（Promega，目录号：G3250）
注意：*如果DeadEnd TM 正在使用荧光TUNEL系统（Promega，目录号：G3250），则化学品/标有星号（*）的试剂不需要采购。见下文注2。
氯化钠（NaCl）（AMRESCO，目录号：0241）
氯化钾（KCl）（AMRESCO，目录号：0395）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（AMRESCO，目录号：0404）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（AMRESCO，目录号：0781）
多聚甲醛粉（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1909）
柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S1804）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
三羟甲基氨基甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
二甲胂酸钠*（Sigma-Aldrich，目录号：C4945）
氯化钴（II）六水合物*（Sigma-Aldrich，目录号：C8661）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：10708984001）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：10708984001。
牛血清白蛋白（BSA）（AMRESCO，目录号：0332）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03620）
荧光素-12-dUTP *（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0101）
dATP *（Promega，目录号：U1202）
末端脱氧核苷酸转移酶，重组（rTdT）*（Promega，目录号：M1871）*
柠檬酸钠
盐酸（HCl）
碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：81845）
无DNA酶蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2544）
1x磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4（参见食谱）
固定缓冲液（见配方）
100 mM柠檬酸溶液（见食谱）
100mM柠檬酸三钠二水合物溶液（参见食谱）
100mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.0（参见食谱）
渗透溶液（见配方）
蛋白酶K（参见食谱）
平衡缓冲器（见配方）
核苷酸混合物（参见食谱）
TUNEL反应混合物（参见食谱）
20x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（见配方）
2x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（参见食谱）
碘化丙啶储备溶液（1μg/μl）（见配方）

设备

0.2-2μl移液器（Gilson，PIPETMAN Classic ®）
2-200μl移液器（Gilson，PIPETMAN Classic ®）
100-1,000μl移液器（Gilson，PIPETMAN Classic ®）
体积为20毫升，50毫升和100毫升的玻璃烧杯（德国Schott Duran）
试剂瓶，杯体积为50毫升，100毫升，500毫升和1,000毫升（任何标准品）
实验室通风柜（任何标准品）
磁力搅拌器（Genetix Brand，India）
水浴（任何标准品）
共聚焦显微镜（尼康，型号：尼康A1R）

软件

Image J标准版本1.46r（ http://imagej.net/mbf/ ）
NIS Elements AR（Nikon，Japan）或用于共焦显微镜图像采集和分析的可比软件

程序

注意：已经描述了下面提到的步骤，用于在从1-4周龄的水稻（Oryza sativa cv.IR64）幼苗的根组织中获得的样品中进行原位TUNEL测定。对于大于4周的水稻植物的根组织，或对于其他草本植物物种的根组织，可以相应地调整容器和试剂的体积。

种子发芽，生长条件和样品处理
种子可以在水培系统中或在蛭石中或在固体培养基上发芽。对于水稻，建议的生长条件是28±2℃和16小时/ 8小时光周期（Tripathi等人，2015）。在所需天数（例如15天）生长之后，通过使用剃刀刀片切割将根组织从幼苗中分离出来。
固定术
1. 从植物中固定根部样品，其中DNA片段化和PCD必须通过在4℃下将固定缓冲液中的根孵育16小时来评估。确保根部完全浸入固定液中。固定可以在50ml管中进行，其盖子正确关闭。
  注意：固定缓冲液含有多聚甲醛 - 支气管，眼睛和皮肤刺激物。请参阅“食谱”部分中关于固定缓冲液的准备和处理的注意事项。
2. 用无水乙醇洗涤固定的根（通过加入无水乙醇，温和振荡10-15秒），室温下洗涤两次。洗涤后，在4℃下将根样品在70％乙醇中培养24小时。解决方案（见注1）。
3. 将样品在1x PBS（见食谱）中孵育20分钟。取出溶液，用新鲜的PBS重复此步骤三次，彻底清除痕量的乙醇
透
1. 从PBS溶液取出根样品，并将样品在100毫升柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中（见食谱）在新鲜管中室温孵育15分钟。
2. 根据根组织的厚度将受试根样品浸入柠檬酸钠缓冲液至微波（350W）持续30-60秒。为了使样品进行微波辐射，根部样品可以放置在200ml微波安全玻璃烧杯中。这些烧杯中柠檬酸盐缓冲液的体积应足以确保样品完全浸泡。对于从1-2周龄水稻幼苗获得的根部样品，通常足够的缓冲液体积为100ml。通过加入等体积的蒸馏水快速冷却样品。
3. 取出溶液，并将渗透溶液（见食谱）中的样品在37℃静置30分钟，并在间歇摇晃的水浴中。
4. 为了消化蛋白质，加入不含DNA酶的蛋白酶K（参见食谱）至终浓度为20μg/ ml，然后在间歇摇动的水浴中于37℃温育30分钟。
5. 取出溶液，并在室温下用1x PBS洗涤根部样品三次
TUNEL反应
1. 对于原位 TUNEL测定，使用锋利的剃刀刀片和玻璃板从根尖切割约1厘米长度的根部样品。在微量离心管（2 ml）中收集切割根尖，每个样品一根管。现在可以在这些管中进行TUNEL反应。
  注意：切割根部样品时，应避免机械损坏，因为剃须刀应该锋利。
2. 准备TUNEL反应混合物（参见食谱），并向每个微量离心管中加入110μl混合物（见下文注2）。反应应在37℃下进行1小时。微量离心管应用铝箔覆盖，以避免曝光。
  注意：步骤C2应该在C1之后立即执行。
3. 通过加入1ml 2ml盐酸柠檬酸钠（2x SSC）缓冲液（pH 7.0，参见食谱）停止反应。
4. 通过加入100μl的1μg/ ml碘化丙啶溶液（最终浓度，参见食谱）去除2x SSC溶液并用碘化丙锭染色根尖，并在37℃下孵育10分钟。取出PI溶液，用1x PBS洗涤三次。
  注意：微量离心管应用铝箔覆盖，以避免暴露在光照下。
5. 使用Antifade安装试剂将根尖装载到载玻片上。对于这项研究，我们已经使用ProLong ® Gold Antifade试剂与DAPI（Thermo Fisher Scientific，USA）。
6. 在共聚焦显微镜下，使用405nm（对于DAPI）和488nm-（对于PI和荧光素） - 适用，以及基于相应染料的发射范围的通道设置可视化载玻片。代表性的图像如图1所示
  
  图1.显示盐胁迫处理的水稻根组织进行TUNEL测定以评估原位DNA片段化的显微照片。根据上述方案，将来自15天龄水稻幼苗的根组织进行盐胁迫（200mM NaCl）60小时，然后进行TUNEL测定。 F：荧光素（绿色），PI：碘化丙啶（红色），DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（蓝色）。将样品安装在载体（ProLong®®>>>>>>> D D D D D D D D D。。。。。on on on on on on on on on on on。。。。。。。。。。。。。。。。。） NIS Elements AR软件（Nikon，Japan）用于获取和处理图像。 DAPI和PI用于染色DNA（损伤和未损伤）。荧光素荧光（绿色）是由于在TUNEL反应期间引入荧光素-12-dUTP，并且对应于游离DNA末端的数目。刻度棒=100μm。

数据分析

在TUNEL反应期间掺入标记的dUTP理论上与游离DNA末端的频率（其主要是由于DNA断裂而产生）的频率成正比，因此，将指示DNA断裂的程度，其又可以提供粗略的估计的PCD。通过使用诸如ImageJ（ http://imagej.net/mbf/ ）或NIS Elements（Nikon，Japan）。 ImageJ的文档部分介绍了ImageJ的荧光强度分析，可以在URL中找到： https://imagej.nih.gov/ij/docs/ 。选择投资回报率和分析图像强度的途径之一是Analyze＆gt;工具＆gt;投资回报率管理器，通过其可以访问投资回报率管理器。可以选择选择工具，并且可以通过绘图来选择ROI。接下来，为了分析强度，在ROI管理器窗口中单击“添加[t]”，然后单击“度量”，这将给出最大值，最小值和平均强度值以及ROI的面积。有关图像处理和分析的详细说明可以在ImageJ文档部分和教程和示例部分（ https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html ）。或者，当根部的纵向切片用于TUNEL测定时，可以通过计数显示荧光素荧光的细胞数和所定义的ROI中的细胞总数来确定TUNEL阳性细胞的频率。不考虑所选择的方法，显微镜的捕获设置和ROI的面积应保持与要比较的样品相同。在研究不同植物的胁迫适应性时，通过分析荧光强度对DNA片段化程度的相对评估通常用于目的。

笔记

在缓冲液或乙醇中培养全根样本应在适量的烧杯中进行。在孵化期间，烧杯/管子应正确覆盖铝箔。应仔细进行洗涤或孵育后的溶液的倾析/去除，以免干扰根部样品，并立即进行下一步骤，以避免样品干燥。

为了进行TUNEL反应，对于我们最近的研究（Tripathi等人，2016），我们使用平衡缓冲液，核苷酸混合物（含荧光素-12-dUTP）和重组末端脱氧核苷酸转移酶（rTdT）随附的 DeadEnd TM 荧光TUNEL系统（来自美国Promega）。然而，使用试剂（分子生物学级）制备的缓冲液和反应混合物，以及单独采用的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶和荧光标记的dUTP也可用于进行TUNEL反应。缓冲液的制备和反应混合物的组成如下。

食谱

1x磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4（1,000ml） 8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
溶解在800毫升去离子水中，并用去离子水将体积调至1,000毫升。在室温下存放
固定缓冲液（4％多聚甲醛[在1×PBS中制备，pH 7.4]）
称取20g多聚甲醛，加入1×PBS以使体积达到500ml。为了正确溶解，将封闭的瓶子在65°C的水浴中加热1.5-2小时。溶液可以储存在4°C 注意：可以注意到，多聚甲醛是相当危险的，是支气管，眼睛和皮肤刺激物，因此应在通风柜中称重。使用后的固定缓冲液应通过在危险废物容器中排空而丢弃。
100 mM柠檬酸溶液
2.10克柠檬酸一水合物在100ml去离子水中。溶液可以储存在4°C
100mM柠檬酸三钠二水合物溶液
2.94克柠檬酸三钠二水合物在100ml去离子水中的溶液。溶液可以储存在4°C
100mM柠檬酸钠缓冲液（100ml），pH6.0
混合11.5ml 100mM柠檬酸溶液和88.5ml 100mM柠檬酸三钠二水合物溶液。确保所得溶液的pH值为6.0。溶液可以储存在4°C
渗透溶液
0.1％Triton X-100在100mM柠檬酸钠缓冲液中，pH6.0。解决方案应该是新鲜的
蛋白酶K
在10mM Tris-Cl，pH7.5中制备20mg / ml。酶溶液应储存在-20°C
平衡缓冲器*
200mM二聚氰酸钠（pH6.5）
25mM Tris-Cl（pH6.5）
2.5 mM氯化钴
200μM二硫苏糖醇
250μg/ ml牛血清白蛋白解决方案应该是新鲜的
核苷酸混合*
10mM Tris-HCl（pH7.5）
1 mM EDTA
60μM荧光素-12-dUTP
100μMdATP
混合物应保存在-20°C
注意：如果正在使用Fluorometric TUNEL系统（美国Promega）的DeadEnd TM ，则用星号（*）不需要准备，因为试剂盒提供了类似的试剂。见上文注2。
TUNEL反应混合物（每次反应）
100μl平衡缓冲液
10μl核苷酸混合物
rTdT（Promega，USA）的60U（2μl）
组合应该是新鲜准备的
20x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（100ml），pH7.0。
3 M（17.54 g）氯化钠（NaCl） 0.3M（8.82g）柠檬酸钠
溶于80ml去离子水中;用盐酸（HCl）将pH调节至7.0，用去离子水将最终体积调至100ml。溶液可以在室温下储存
2x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（100ml） 10 ml 20x SSC，pH 7.0
90 ml去离子水
碘化丙啶储备溶液（1 mg / ml）
将10毫克碘化丙啶溶于10ml 1x PBS中注意：该溶液要在4℃下在黑暗中储存。此外，碘化丙啶可能是致癌的。避免接触皮肤，并在处理溶液时穿上适当的防护服。碘化丙啶溶液在使用后应通过在危险废物容器中排空而丢弃。

致谢

我们实验室的研究得到了生物科技部（DBT），科技部，印度政府和ICGEB的资助。 AKT一直是印度政府DBT的高级研究奖学金的获得者，非常感谢。本文提出的方案详细描述了在我们最近的研究（Tripathi等人）中用于TUNEL测定以评估各种应激条件下根组织中的DNA断裂和程序性细胞死亡的更广泛的方法>，2016）刊登在“植物生理学”杂志上。

参考

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