材料和试剂

Falcon培养处理的烧瓶，225cm 2（Corning，Falcon ®，目录号：353139）
Falcon 15 ml锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352097）
5 ml血清移液管（MIDSCI，目录号：MWB-5）
Fisherbrand高级微量离心管，1.5 ml（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
IBIDIμ-Slide VI 0.4 ibiTreat，无菌幻灯片（IBIDI，目录号：80606）
Fisherbrand P200低保留气溶胶屏障移液管吸头（Fisher Scientific，目录号：02-717-165）
Falcon Petri Dish 150 x 15 mm（Corning，Falcon ®，目录号：351058）
Greiner Petri Dish 35 x 10 mm（Greiner Bio One International，目录号：627161）
三通硅胶管，1.52 mm I.D. （Cole-Parmer，目录号：SK-07624-36）
弯头路厄连接器（IBIDI，目录号：10802）
Falcon圆底聚丙烯管（Corning，Falcon ®，目录号：352006）
EASYStrainer，70μm细胞筛，无菌（Phenix Research Products，目录号：TCG-542070）
Falcon 50ml锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352098）
1 cc结核菌素注射器柱塞
SHARP P1000精密阻隔移液管吸头（Denville Scientific，目录号：P1126）
EASYStrainer，40μm细胞筛，无菌（Phenix Research Products，目录号：TCG-542040）
10ml血清移液管（MIDSCI，目录号：MWB-10）
Fisherbrand硼硅酸盐玻璃巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
纸巾
EMD-Millipore Stericup真空过滤器，500ml（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
Parafilm M TM （Bemis，目录号：PM996）
道康宁硅胶实验室管材1.57毫米x 3.18毫米O.D （道康宁，目录号：2415569）
人骨髓（BM）MSC（全骨髓抽吸物）（AllCells，目录号：ABM001-0）使用Ficoll梯度随后通过塑性粘附从全骨髓中分离MSC，然后在MSC培养基中培养（参见食谱） /> 注意：由于存在典型的MSC生长，外观和表面标志物表达，用于这项工作的MSC被预先筛选，并在其使用前扩展用于库存循环保存（Sekiya等人，2002; Dominici等人， 2006）。
雄性C57BL / 6小鼠（JACKSON LABORATORY，目录号：000664）;推荐年龄在2-4个月以前
Hyclone Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液，500ml，不含钙的镁（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30028.FS）
Gibco-Tryp-LE Express酶，1x，500ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12604021）
千分尺 - 台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15250061）
亚特兰大生物胎牛血清（FBS），胚胎干细胞合格，500毫升（亚特兰大生物公司，目录号：S10250）
红细胞裂解缓冲液hybri-max（Sigma-Aldrich，目录号：R7767-100ML）
脂多糖，BioXtra（Sigma-Aldrich，目录号：L6529）
R＆amp; D系统小鼠TNF-αQuantikine ELISA试剂盒（R＆amp; D Systems，目录号：MTA00B）
用谷氨酰胺和核苷介质进行的HycloneMEMα修饰（GE Healthcare，Hyclone TM，目录号：SH30265.FS）
Gibco-Penicillin-streptomycin，10,000U / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
MSC媒体（见食谱）

设备

Hettich Rotofix 32A带有15毫升和50毫升锥形管的旋转桶（Hettich Lab Technology，型号：Rotofix 32A）
带真空抽吸的无菌罩（贝克公司，型号：SterilGARD ® III Advance ）
Hausser Scientific Bright-Line TM带有玻璃杯的计数室（Hausser Scientific，目录号：3110V）
P2-20 XL3000i移液器（Denville Scientific，目录号：P3950-20A）
注意：本产品已停产。
P20-200 XL3000i移液器（Denville Scientific，目录号：P3950-200A）
注意：本产品已停产。
P100-1000 XL3000i移液器（Denville Scientific，目录号：P3950-1000A）
注意：本产品已停产。
三洋CO 2培养箱（SANYO，型号：MCO-18AIC）
Ismatec REGLO蠕动12辊泵（Cole-Parmer，目录号：ISM796B）
Hettich Mikro 200R冷冻微量离心机（Hettich Lab Technology，型号：MIKRO 200R）
色谱酶标仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax M2）
注意：本产品已停产。
37°C水浴（Fisher Scientific，型号：Model 210，目录号：15-462-10Q）
注意：本产品已停产。

程序

播种MSCs
1. 将经冷冻的人类骨髓（BM）MSC冷冻储存液以每个冷冻小瓶2百万条解冻，并在37℃下具有5％CO 2 。理想通道介于1-5之间。 2〜3天后，实验使用80％贴壁细胞融合
2. 完全取出培养基，加入5ml无菌DPBS室温冲洗细胞单层。完全吸出。
3. 加入5ml Tryp-LE Express离解试剂。允许体积扩散到单层，将烧瓶置于组织培养箱内5-8分钟
4. 通过加入5毫升MSC培养基收集细胞悬浮液（参见食谱）以减少Tryp-LE效应。将内容物加入干净的15 ml锥形离心管中
5. 用2-3ml的MSC培养基重新冲洗烧瓶以收集残余细胞
6. 将内容物加入同一个15 ml离心管中
7. 将离心管放入旋转铲斗台式离心机（Hettich Rotofix 32A）中，并以617“x”（2000 rpm）旋转悬浮液5分钟。
8. 使用真空吸力吸出媒体混合物，不会干扰细胞沉淀
9. 用手指轻轻敲打15 ml离心管的圆锥形末端，以帮助球团脱落。通过与5ml血清移液管轻轻混合，将2 ml MSC培养基重新悬浮细胞沉淀
10. 一旦混合，快速取10μl细胞悬浮液等分细胞进行细胞计数，并将其置于新鲜的1.5 ml微量离心管中。加入悬浮液，10μl台盼蓝。通过移液5-8次混合。
11. 取最终10μl该溶液的等分试样，并放入带有玻璃杯的血细胞计数仪（Hausser Scientific）（图1）。
  
  图1. MSC的细胞计数配置文件。 200μm中四个象限之一的示例。
12. 计数四个外象限。细胞数应该接近并且不少于每个象限约30个细胞（图1）
13. 计算细胞浓度（每ml细胞数）乘以4象限计数乘以稀释因子2乘以因子2,500的总和。这将等于每毫升细胞。
14. 一旦计算出每毫升的细胞数，取所需的细胞悬液等分试样，以获得每毫升2×10 5个细胞。
15. 使用的载玻片是通道体积为30μl的IBIDI VI 0.4 六通道载玻片。使用P200移液器和提示将32μl您的细胞悬浮液加入每个通道。将移液器吸头插入滑道容器，并将细胞直接注入通道（图2A）
  
  图2. IBIDI VI的种子方法 0.4 幻灯片。 A.将细胞悬浮液直接吸入幻灯片水槽内通道; B.所有渠道填补;加湿室设置。
16. 如果在添加细胞后形成气泡，拿起IBIDI滑块，轻轻敲击边缘，以使气泡朝向通道的储存器移动。将幻灯片盖板放在IBIDI幻灯片上（图2B）。
17. 将载玻片放入15厘米的陪替氏培养皿中，装有一个装有3毫升DPBS的35毫米培养皿（图2C）。将盖子放回15厘米的盘子上。
  注意：此设置为IBIDI幻灯片提供了一个“加湿室”，可防止组织培养箱内的介质蒸发。
18. 将培养皿放入37℃的培养箱中，使细胞附着30分钟
19. 30分钟后，取出滑块，并通过移液管分配每个通道储液罐2滴，直到完全分离125μl的MSC培养基来填充个体通道。
  注意：每个通道的这种交替逐滴分配媒体有助于最大限度地减少流量中断，从而允许非连接的MSC均匀地通过通道。
20. 在37°C的时间过夜。
为WSS设置IBIDI幻灯片
1. 在WSS之前，必须在IBIDI幻灯片的每个通道中补充媒体。需要每个治疗组（静态，WSS和其他条件）的重复通道，以便在随后的ELISA测定中获得足够的培养基进行分析。每个通道都有一个储存口。从一端抽出125μl旧的培养基，不要在通道内抽出30μl的体积（见视频1，开始时间为1:21分钟）。
  
  Video 1. Demonstration of steps 1-5 for setting up IBIDI slide for WSS
2. 向对面的水库口，加入125μl新鲜的MSC培养基。重复一次以确保媒体的完整更改。
3. 等待WSS开始前一个小时。在此期间，设置了REGLO蠕动泵以及三通管，滑动弯头连接器和圆底14ml离心管，预填充6 ml MSC培养基。这是流量储存器，将为IBIDI滑块的各个通道供应再循环。每个通道都有一个单独的6毫升WSS储存器。静态样品不接收循环介质，除非需要或需要低流量以维持细胞的健康
4. 通过调节25-35之间的蠕动泵上的模拟速率，预先填充三通管路与介质，直到弯头连接器端。当介质靠近弯头连接器孔口的末端时，请关闭蠕动泵。将弯头连接器固定并滑动到滑块的第一个储存口。弯管连接器与管道相对运行，连接到相应通道的储存口。该管的末端进入离心管。重复以后的滑动储存器端口。完全组装，幻灯片应与视频1和图3中的相似。
  
  图3. IBIDI幻灯片的WSS设置：IBIDI幻灯片的单个通道的原理图和实际管道/泵故障
5. 将REGLO蠕动泵设置设置为85，等于8.5 ml / min。
  注意：Dyne是以1厘米/秒的速度加速1克质量所需的力的单位。在微流体中，这种力称为剪切应力，或者与通道壁的距离为零，壁面剪切应力（WSS）。 IBIDI VI 通道上的此流量产生〜10.8达因/厘米 2 http://ibidi.com/img /cms/support/AN/AN11_Shear_stress.pdf
6. 将整个组件放入培养箱中，并在一个小时的潜伏期后启动泵。
7. 固定孵化器门并设置定时器3小时。
  注意：WSS采用注射泵的替代方法，可以最大程度地减少流动脉动（Li et al。，2014）。
收获脾细胞
1. 在WSS结束前1.25小时，继续从雄性C57BL / 6小鼠收获脾脏。推荐年龄在2-4个月之间。取出脾脏后，将组织浸入10ml冷冻的PBS中。运送到实验室。
2. 倒出PBS。在50ml锥形管中准备一个70μm过滤器（蓝色边框）。把脾脏放在过滤器上。使用1cc结核菌素注射器柱塞，通过过滤器完全粉碎组织
3. 使用血清移液管，用PBS中的冷冻2％FBS冲洗过滤器的顶部。冲洗最多10至15 ml缓冲液。过滤器的底部，使用移液器上的1,000μl移液管吸头，取出细胞缓冲液混合物的残留悬浮液，并加入细胞悬浮液中。
4. 在4℃下以640×g旋转5分钟。离心后，注意上清液是浑浊的，但底部有一个“红”颗粒。倒出上清液，不要打扰沉淀。
5. 加入6ml RBC裂解缓冲液，并用5ml血清移液管用缓冲液分离沉淀。然后让混合物在冰浴上放置7分钟的孵育时间。
  注意：如果脾细胞混合物在RBC裂解缓冲液中留下太长时间，可能会影响细胞表现。
6. 使用新鲜的50ml圆锥形设置40μm过滤器。向细胞悬浮液中加入20至30ml的PBS缓冲液中的2％FBS以帮助猝灭RBC裂解缓冲液。用10ml血清移液器吸取悬浮液，并将其穿过40μm过滤器
7. 更换血清移液管并取出10ml的FBS-PBS缓冲液。冲洗原来的50ml锥形管，用于RBC裂解，然后将悬浮液转移通过相同的40μm过滤器
8. 再次使用1,000μl的吸头，收集过滤器下的任何残留细胞悬浮液，并转移到细胞悬浮液中
9. 在4℃下以650×x×10分钟旋转10分钟
10. 仔细倒出上清液，加入10 ml的MSC培养基。重新悬挂颗粒并进行细胞计数。从一只小鼠脾脏中可以提取四千万到六千万个脾细胞，因此建议在服用10μl样品进行计数之前，在MSC培养基中稀释等分试样1:10。
11. 将10μl的1:10等分悬浮液和10μl台盼蓝混合。转移10μl染色细胞，放入带有玻璃杯的血细胞计数器
12. 计数四个外象限。如前所述，每个象限约30个细胞将提供细胞浓度（每毫升细胞数）的准确估计
13. 一旦计算每毫升细胞，取所需的细胞悬浮液等分试样，以获得每毫升6×10 6个细胞。如果需要，将体积调整至1 ml。
准备共同文化
1. MSCs与脾细胞的推荐比例为1:30。在WSS曝光时间完成后，拆卸REGLO泵和通道储存器。从IBIDI幻灯片中分离肘连接器。
2. 使用P200移液器和尖端，从墨盒的一端取下介质，直到只有通道包含介质（两个储存器应为空）。在幻灯片储存器的另一端添加125μl新鲜介质，以冲洗通道。再重复一次。
3. 再次从墨盒中取出介质，而不是通道的音量。使用轻型真空和玻璃巴斯德吸管，将P200吸头固定在末端，小心吸出通道中的所有介质，仅留下MSC。快速工作
4. 使用P200移液器，轻轻混合脾细胞悬液。取30μl，并注入IBIDI通道，直接进入通道，而不是简单地填充储存器。对所有渠道重复：静态，WSS，其他治疗，等等。
  注意：始终确保在绘制之前混合脾细胞悬浮液，以保证每个通道的细胞数量一致。
5. 将载玻片与共培养物置于用作加湿室的15厘米培养皿中。将载玻片放入培养箱中30分钟。这一次对于MSC-脾细胞相互作用是重要的
6. 您将需要一种仅用于脾细胞培养，作为LPS治疗和非治疗对照。使用新鲜的IBIDI VI 0.4 幻灯片，并用30μl脾细胞填充四个通道。
7. 允许用共同培养的载玻片孵育30分钟。
8. 30分钟后，通过轻轻分配45μlMSC培养基填充通道储存器。
9. 以2μg/ ml制备2x浓度的脂多糖（LPS）。原液为1 mg / ml，通道最终浓度为1μg/ ml
10. 在幻灯片通道中将有75μl的媒体音量。加入75μl2x LPS，在每个通道储存器端口间交替〜2滴，直到为一个通道分配75μl。在幻灯片上的所有通道充满后，用拇指和食指轻轻拿起幻灯片，并从储存口侧面小心摇晃10次，以使介质流动并混合。不要让介质溢出到油箱端口边缘上方，导致介质损坏。这种摇摆运动允许LPS与共培养细胞和仅复制脾细胞治疗组的适当混合。其他复制脾细胞集合仍然未经处理，只有MSC培养基。将滑盖放在滑块顶部，放在加湿室中。
11. 放在孵化器长达18小时。
mTNFαELISA测定
1. 必须将mTNFαELISA试剂盒（R＆amp; D Systems）从冰箱中取出并使其平衡至室温至少30分钟。 TNFα对照和TNFα标准物均应用1ml双去离子水重构。 25x洗涤缓冲液也应该解冻。
2. 在共培养细胞和仅脾细胞控制条件（LPS处理和未处理）孵育后，从重复通道收集培养基，将每个处理组的两个通道组合在一起，分别标记为1.5ml微量离心管。两个重复通道的体积约为300μl。将微量离心管放在冰上。
3. 将试管转移到冷藏台式离心机中，并在4℃下以650×g离心5分钟。这个步骤需要去除任何细胞碎片和脾细胞。
4. 离心后，将培养基上清液转移到新鲜的预先标记的管中。用碎屑丸丢弃第一根管。
5. 请点击链接到第5和第6页的TNFα标准品制备和测定程序。为每个使用适当的稀释剂并继续。 https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/ mta00b.pdf 。
  注意：第6页，第3步和第4步的R＆amp; D ELISA测定程序建议将RD1-63稀释剂的介质样品1：1稀释到预处理的孔中，重复。应该对TNF-α标准和对照进行。对于实际样品，我们的经验表明，未稀释的样品进入孔，与RD1-63稀释样品相比，允许与RD1-63稀释样品相比持续的pg / ml TNF-α值，其可能有时不一致，可能是由于介质中的干扰物质。我们在每个条件的双重孔中直接使用100μl的培养基样品，包括仅使用脾细胞样品（LPS）和未处理的样品。在获得pg / ml值后，通过乘以0.5的因子减少最终样品值，将其标准化为稀释的标准品和最初稀释的对照值。
6. 继续从第6页第9步的R＆amp; D测定程序链接，加入100μl'Stop Solution'后，用纸巾擦拭底部孔板表面，以吸收洗涤液中的任何水分，并立即获取光密度读数使用设置在450 nm波长的Spectra MAX M2微孔板读数器。波长校正虽然由于与底部井表面缺陷相关的光密度差异非常小的差异而不需要推荐。
7. 标准和对照mTNFα的浓度（pg / ml）由1，因为RD1-63稀释剂稀释了一半。要计算实际的介质样品浓度，必须包括0.5的倍增因子才能标准化和控制。

数据分析

根据酶标仪在样品上检测到的TNFα的浓度（pg / ml），绘制初始垂直条形图，绘制LPS处理的'和'未处理'脾细胞和共培养的静态和WSS样品。另外，绘制TNFα阳性对照。
注意：TNFα阳性对照储备小瓶的印刷范围为培养基样品的pg / ml浓度，这可以确定测定本身是否有效。如果控制数字落在介质的储存小瓶的打印范围内，则该测定正确执行。
如果测定效果很好，LPS处理的“脾细胞控制”将具有最高的mTNFα读数/浓度。未经治疗的脾细胞控制将注册在零附近，因为在未激活的脾细胞中TNFα的产生很少或不产生（图4）。
注意：未剪切状态的MSC具有减少炎症反应或在这种情况下是mTNFα的脾细胞分泌的能力。在WSS诱导的MSC中，抗炎反应增强。

图4.每个条件的TNFα水平的初始图
从mTNFα浓度产生的数字，使用LPS处理的脾细胞将所有值归一化为百分比，代表TNFα产生的最大容量（100％）。静态，WSS或其他治疗组相对于“处理”脾细胞的mTNFα的减少百分比将提供MSC免疫调节性能的相对量度（图5）。

图5.比较WSS与静态共同文化的减少百分比图。 WSS暴露的MSC显示增强的免疫调节活性

注意：图4和图5中显示的数据来自一个代表性的实验，在“数据分析”下证明了获得和绘制TNFαELISA测定数量的程序。所描述的过程不包括技术重复。相反，我们赞成真正的生物重复来建立重复性，这些可能包括在不同的日子里建立的实验或使用不同的细胞系。请参阅我们以前的手稿（Diaz et al。，2017），对这种免疫调节现象进行统计学重现的数据进行更深入的研究。