材料和试剂

无菌Eppendorf管（国家科学，目录号：CN1700-BP）
组织路径Macrosette处理盒（Fisher Scientific，目录号：15-182-706）
玻璃幻灯片
8-10周龄的老鼠在家里生产或从商业供应商获得
注意：Das等人（2015）研究中使用的小鼠是129 / Sv和C57BL / 6J混合背景。这项研究中的小鼠是同窝同胞，包括在特定无病原体（SPF）条件下的男性和女性。
葡聚糖硫酸钠（DSS）（TdB咨询，目录号：DB001，分子量：35-55 kDa）
注意：存放在室温的干燥处。
液氮
高压灭菌饮用水
麻醉（异氟烷或CO 2 ）
10％缓冲福尔马林（Fisher Scientific，目录号：SF100-4）
乙醇
二甲苯
石蜡
Vana miRNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM1560）
生物分析仪（Agilent Technologies，Waldbronn，德国）
DNase I（QIAGEN，目录号：79254）
寡核苷酸或随机六聚体引物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：100023441）
SuperScript逆转录酶II（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：18064014）
Light Cycler 480 SYBR Green mix（Roche Molecular Systems，目录号：04707516001）
苏木精和伊红（H＆amp; E）

设备

测量秤/标尺或游标卡尺
动物称重平衡
喂奶瓶
Tissue-Tek VIP加工机
解剖设备
鼠标微型隔膜室
杵和砂浆

程序

在第0天，根据研究所批准的适当方法（耳标，耳冲等）标记对照组和实验组中的所有小鼠。重要的是，可以监视DSS管理后，单独标记小鼠，以便体重，粪便稠度，粪便中的血液等。在处理它们之前称重所有的小鼠（理想情况下，小鼠的体重约为20g），将高压灭菌的水或DSS溶解在高压灭菌的饮用水中。如果需要，收集粪便样品。
通过溶解DSS粉末，在高压灭菌的饮用水中准备适当浓度的DSS（基于研究中的问题，请参见下面的步骤3），直到达到澄清溶液。每个笼子用4-5只小鼠将大约100毫升的水瓶装入笼子中2天。 2天后丢弃剩余的水，并补充新鲜制备的DSS含水。
对于损伤修复模型，饮用水中的2％DSS（即，在100ml中的2g）在前7天施用，然后经常饮用水另外7天。然而，DSS之后的常规用水天数可以根据研究中的问题进行更改。例如，如果研究中的问题不涉及恢复或修复阶段，则DSS管理可以在第7天终止，或者如果需要延长的炎症期，可以继续进行。为了确定存活率，可以给予饮用水中3％的DSS，直到对照组或实验组中的所有小鼠达到人道终点。理想情况下，人性化的终点是当小鼠达到道德委员会批准的规定体重减轻时。此外，严重和血腥的腹泻伴随着臀部位置，皱纹毛皮和流动性下降被认为是人道端点，小鼠应通过认可的方法处死。
用DSS治疗的小鼠将失去大量的体重，因此，应每天称重以监测健康状况，并确保根据批准的道德标准，在人性化终点处死小鼠。此外，每天应监测小鼠的粪便稠度（0 =良好形成的粪便丸，2 =半形式粪便，4 =粘附于肛门区域的液体粪便）和粪便中的血液（0 =无血液，2 =血液痕迹在粪便中清晰可见，4 =总直肠出血）。记录此信息的个人应该对学习感到失明。可以绘制体重减轻，腹泻和粪便出血评分，以确定DSS诱导的结肠炎在不同基因型和/或治疗组之间的作用。作为一般指导，小鼠在DSS治疗的第6天左右开始体重减轻，直到第10天（DSS去除后3天），比初始体重减少约15-20％，继续减肥。在此期间，小鼠显示行为改变，如食欲降低，背部姿势，皱纹毛皮等。在第10天后，小鼠通常开始体重增加并达到初始体重大约14天然而，这可以根据微生物群组成，动物设施而变化，因此应该仔细解释。
在DSS（7天）和常规水（7天）的循环后，在第14天，小鼠可以根据伦理委员会（IACUC）批准的适当方法进行安乐死。应使用标尺或游标卡尺测量结肠长度，因为DSS给药导致结肠肿胀和缩短。结肠块（〜0.5cm）可以在液氮中快速冷冻，进一步加工用于RNA提取和基因表达分析。对于组织学，其余组织可以使用组织路径Macrosette处理盒在瑞士卷发并储存在10％缓冲福尔马林中。在福尔马林固定48-72小时后，将组织样品从福尔马林中取出并置于70％乙醇中直到进一步进行组织处理和包埋。通常，使用Tissue-Tek VIP处理机，然后进行石蜡包埋，可以进行组织处理过夜（表1）。

表1.组织处理协议
使用Vano miRNA分离试剂盒根据制造商的说明书，可以将液氮中的冷冻组织用于匀浆后的RNA提取（使用无菌杵和研钵），可用于分离总RNA以及小RNA。建议使用DNase I（QIAGEN）根据制造商的说明进一步处理提取的RNA，以获得无DNA污染的纯RNA。根据制造商的说明书，使用oligo-dT或随机六聚体引物和SuperScript逆转录酶II（Thermo Fisher Scientific）将RNA进一步转化为cDNA。在DSS结肠炎期间上调的促炎细胞因子如TNF-α和IL1-β的表达可用作DSS诱导的结肠炎的有用标记物。
Fomalin固定组织可以进一步石蜡包埋，切片并安装在载玻片上用于组织学分析。对于组织学评分分析，组织切片可用苏木精和曙红（H＆amp; E）染色，并以盲法方式由小鼠病理学家评分。简而言之，0-3的分数被指定为炎症细胞的浸润，0-3被指定为组织损伤。最后，“0”的综合得分将表明健康的肠道相比，得分6，这将表明广泛的浸润和组织损伤。免疫组织化学染色免疫细胞如巨噬细胞（F4 / 80），凋亡细胞（Caspase 3），上皮结构丧失（E-钙粘蛋白）是DSS诱导的结肠炎的可靠指标。
由于与近端结肠相比，DSS的作用在远端更明显，可以分开进行近端和远端结肠的组织学评分。

数据分析

适用的统计方法应适用于数据分析
对于包括生存曲线，粪便血液评分，基因表达分析和组织学图像的代表性数据，我们将读者引用到Das等人，（2015）图2,3,4和5.

笔记

执行的所有程序应由各机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。参与本研究的动物必须受到人道待遇，并且在使用小鼠的所有情况下，疼痛和不适应最小化。
重要的是不要混合来自不同来源的小鼠，因为它们可能具有可能改变DSS诱导的结肠炎结果的不同的微生物组合物。另外，当使用经遗传修饰的小鼠时，除非正在研究特定基因型的母体贡献（例如，子宫内或垂直转移）的作用，否则建议使用同窝出生对照。
DSS的分子量非常关键（分子量：35-55 kDa）

致谢

我们要感谢Batra实验室的成员进行有益的讨论。该协议的作者部分地得到了NCI Fred和Pamela Cancer Center Support Grant P30 CA036727的支持。

参考

Das，S.，Rachagani，S.，Sheinin，Y.，Smith，LM，Gurumurthy，CB，Roy，HK和Batra，SK（2015）。＆nbsp; 缺乏Muc4的小鼠对实验性结肠炎和结肠炎相关结肠直肠癌更具抗性。癌基因 35（20）：2645-2654。

Mizoguchi，A.（2012）。炎症动物模型肠病。 Prog Mol Biol Transl Sci 105：263-320。

Perse，M.和Cerar，A.（2012）。＆nbsp; 葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型：陷阱和技巧生物医学生物技术 2012：718617.

Sartor，RB（2006）。疾病机制：发病机制克罗恩病和溃疡性结肠炎。 Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 3（7）：390-407。