材料和试剂

组织培养板96孔平底（P96）（Corning，Falcon ，目录号：353072或等效物）
培养瓶250ml，75cm 2（Corning，Falcon ，目录号：353136或等同物）
纸巾
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
大肠杆菌菌株（-80℃下保存在LB 20％甘油中）在作者实验室中通常用作阳性对照的菌株是益生菌菌株Nissle 1917或共生小鼠株NC101
Lennox L培养基（LB培养基）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：12780029）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
具有25mM HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：42430）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），目录号：42430）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，GlutaMax Supplement，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31966021）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106或等同物）
非必需氨基酸溶液（NEAA）100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140035）
庆大霉素溶液50mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
二甲醛（PFA）20％（电子显微镜科学，目录号：15713）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
10x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
亚甲基蓝（RAL DIAGNOSTICS，目录号：310950）
Tris-HCl 1 M pH 8.5（Teknova，目录号：T1085）
盐酸（HCl）1 M（Merck，目录号：109057）
HeLa细胞培养基（参见食谱）
固定溶液（见配方）
亚麻蓝染色溶液（见食谱）
亚麻蓝洗涤缓冲液（见配方）
亚甲基蓝提取液（见配方）

设备

Micropipette Research Plus 0.1-10μl（Dutscher，Eppendorf，目录号：035602）
Micropipette PIPETMAN G 20-200μl（Dutscher，Gilson，目录号：066811）
多通道微量移液管30-300μl（Dutscher，Finnipipette，目录号：050667N）
用于细菌培养的培养箱，摇动（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 42）
CO 2细胞培养箱（Forma Scientific）
比色计测量细菌培养物600nm处的吸光度（biochrom，型号：WPA CO7500）
用于600和660 nm吸光度测量的微孔板读数器（TECAN Infinite Pro）
涡旋（Dutscher，型号：Vortex-Genie 2）
倒置显微镜（Olympus，型号：CKX31）
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：MSC-Advantage TM II类）
化学安全罩来处理固定剂

程序

第1天
1. 在-80℃甘油储备液或LB琼脂平板上的菌落上种3ml LB培养物，并在37℃振荡（240RPM）下生长过夜（16-24小时）。
2. 接种在组织培养物中，每孔100μl/孔的完全细胞培养基（DMEM 10％FBS 1％NEAA50μg/ ml）中的96孔（P96）微孔板，5×10 3 HeLa细胞庆大霉素，见食谱）。在37℃5％CO 2加湿培养箱中生长24小时。有关可按P96测试的应变/条件数量，请参见数据分析部分。
第二天
1. 细菌培养
  在具有500μl细菌过夜LB培养物的管中接种到9.5ml预温热（37℃）DMEM 25mM HEPES中。在37℃下振荡（240RPM）生长达到OD 600nm = 0.4至0.5（约2小时）。通过测量1ml培养物的吸光度OD 600nm来确定每ml细菌数。 1单位OD 600nm对应于5×10 8细菌/ ml（大肠杆菌的典型值），其具有WPA colourwave CO 7500色度计）。
2. HeLa细胞洗涤
  同时，用100μl温热（37℃）HBSS小心地洗涤HeLa细胞3次，然后加入每孔100μl的DMEM 25mM HEPES。对于B行，加入200μl而不是100μl（见图1）
  
  图1.板感染方案示例。对于剂量/效应检查，细菌以不同的感染复数（MOI，即，感染开始时每个细胞的细菌数）接种到HeLa细胞中。通常，将细菌以每孔200μl（优选一式两份或一式三份）接种在B行中，然后连续稀释（如图所示2倍）以达到感染剂量效应。最终的相互作用介质体积为100μl。不应使用外围孔来避免改变HeLa细胞生长和反应的边缘效应
3. HeLa细胞感染
  从B列开始接种细菌，以达到每个细胞所需的最大细菌数（感染的多重性，MOI）。对于剂量/效应检查，通过在每行100μl之间转移（参见图1），从行B至G进行连续两倍稀释。通常，第一行B中最高MOI为200，最后一行G中的MOI为6.25。在平板上包括阳性（细菌合成大肠杆菌素）和阴性对照（细菌不合成大肠杆菌素）。将板在37℃下与5％CO 2孵育4小时。使用酶标仪测量600 nm处的吸光度，以监测细菌生长。
4. 感染后
  用100μl预热（37℃）HBSS将细胞洗涤至少三次。在倒置显微镜下检查大多数细菌是否被去除。如果需要，请执行附加洗涤。然后，向每个孔中加入100μl补充有200μg/ ml庆大霉素的完全培养基（DMEM GlutaMax，10％FBS，1％NEAA）。将P96在37℃下与5％CO 2 孵育3天。
第3-4天
每天在倒置显微镜下检查细胞是否有细菌过度生长，如果需要，请用补充有庆大霉素的新鲜培养基替换。
第5天
1. 细胞固定
  用PBS冲洗板两次。在化学安全罩下，用100μl固定液（PBS 4％甲醛，参见食谱）固定20分钟。扔出有毒废物容器中的固定剂，然后用PBS冲洗2次，然后用亚甲基蓝洗涤缓冲液一次（参见食谱）。
2. 亚甲基蓝着色
  用100μl/孔的亚甲蓝染色溶液（参见食谱）染色1小时。用亚甲基蓝洗涤缓冲液冲洗几次（参见食谱），在纸巾上每次洗涤之间敲打板，以清除所有液体。重复一遍，直到纸巾上没有更多的蓝色染色。在室温下空气干燥过夜或在37℃下几小时。
3. 显微镜观察
  用倒置显微镜观察细胞。对照细胞应与正常细胞形态融合。相比之下，感染了高MOI的E细胞。产生大肠杆菌的大肠杆菌（约100个的MOI）应该显示特征在于细胞数量低，巨细胞（巨细胞）和细胞死亡的迹象（凋亡小体，细胞碎片）的细胞病变表型（参见图2）。在E的较低MOI。大肠杆菌产生大肠杆菌素（围绕MOI 25），表型不太明显，正常细胞的胰岛（能够修复中度DNA损伤并恢复增殖）应该是可见的。在MOI < 12细胞与对照细胞相似
  
  图2.在HeLa细胞暴露于 p 4小时后3天观察到的巨细胞增生表型 E。大肠杆菌菌株在感染复数（MOI）为12〜100个细胞/细胞。细胞用亚甲基蓝染色并用20倍物镜拍照。刻度棒=25μm。
4. 基因毒性定量
  亚甲基蓝在100μl/孔的亚甲蓝萃取溶液中萃取，在搅拌下15分钟。将75μl转移到新板上，用微量酶标仪测量660 nm处的吸光度。在MOI和菌株的功能下制备具有OD <660nm 的图，其中对照菌株作为参考。由于细胞生长抑制，衰老（巨噬细胞增多）和细胞死亡，应变是基因毒性越多，着色越少。

数据分析

首先应在显微镜下观察细胞（图2），然后定量亚甲蓝（图3）。定量染色以测量细胞层中的蛋白质含量，从而代表与遗传毒性反相关的全局细胞活力。我们建议至少在每个测试的MOI的技术重复孔中测试每个菌株。因此，可以每个板测试具有剂量效应的五个独立条件（菌株）。如果需要统计分析，执行至少三次独立实验以获得生物一式三份，并在数据对数转换后通过单因素方差分析进行比较。

图3.在4小时展开后3天从HeLa细胞提取的亚甲基蓝的量化到各种MOI + 大肠杆菌，等同性突变体（不产生基因毒素）或与pClbH质粒互补的 clbH 突变体。相对于对照的亚甲基蓝染色的百分比计算为一式三份的孔中的平均光密度（来自一个实验）除以对照（未处理）孔中的平均光密度。数据可以以多重感染（MOI：感染发病开始时每培养细胞的感染细菌数）或感染结束时细菌生长的功能（通过光密度600测量） nm）。这里显示的误差条表示三重孔中平均值的标准偏差。

笔记

所有的HeLa细胞洗涤应谨慎进行，以免损伤或从单层中除去细胞;吸出并缓慢加入培养基（约1-2秒）。

食谱

HeLa细胞培养基（完全培养基）
500毫升DMEM高葡萄糖与丙酮酸和GlutaMax
55毫升胎牛血清
5.5 ml NEAA
50μg/ ml庆大霉素
固定液，1x PBS，4％PFA
5 ml 20％PFA储备溶液
5 ml 10x PBS
40ml蒸馏的H 2 O O
等分并储存于-20°C
亚麻蓝染色液
5克亚甲蓝
500ml 0.01M Tris pH 8.5（亚甲基蓝洗涤缓冲液）
3-4小时内混合
在室温下存放
亚麻蓝洗涤缓冲液
5 ml 1 M Tris pH 8.5
495ml蒸馏的H 2 O O
亚甲基蓝提取液
50ml 1 M HCl
450ml蒸馏的H 2 O O

致谢

该方案基于以前公布的具有大肠杆菌的培养细胞感染方法（De Rycke >等人，1996; Nougayrede等人，2006）。这项工作得到法国国家癌症研究所的支持（授予INCAPLBIO13-123）。

参考

De Rycke，J.，Mazars，P.，Nougayrede，JP，Tasca，C.，Boury，M.，Herault，F.，Valette，A.and Oswald，E.（1996）。＆lt; a class = ke-insertfile“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8613380“target =”_ blank“>暴露于大肠杆菌的HeLa上皮细胞中的有丝分裂阻滞和延迟致死率产生细胞毒性坏死因子1型的BM2-1。 64（5）：1694-1705。
Nougayrede，JP，Homburg，S.，Taieb，F.，Boury，M.，Brzuszkiewicz，E.，Gottschalk，G.，Buchrieser，C.，Hacker，J.，Dobrindt，U.and Oswald，E。（2006 ）。大肠杆菌诱导DNA双链断裂在真核细胞中。科学 313（5788）：848-851。
Putze，J.，Hennequin，C.，Nougayrede，JP，Zhang，W.，Homburg，S.，Karch，H.，Bringer，MA，Fayolle，C.，Carniel，E.，Rabsch，W.，Oelschlaeger， TA，Oswald，E.，Forestier，C.，Hacker，J.and Dobrindt，U。（2009）。肠杆菌科家族中大肠杆菌素基因组岛的遗传结构和分布。（11）：4696-4703。

Secher，T.，Samba-Louaka，A.，Oswald，E.和Nougayrede，JP（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm.nih。 gov / pubmed / 24116215“target =”_ blank“>产生大肠杆菌的大肠杆菌触发哺乳动物细胞中过早和可传播的衰老。 8（10）： e77157。

Taieb，F.，Petit，C.，Nougayrede，JP和Oswald，E.（2016）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed / 27419387“target =”_ blank“>肠细菌基因毒素：细胞致死性扩张毒素和大肠杆菌素。 EcoSal Plus 7（1）。