材料和试剂

15 ml和/或50 ml离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352096和352070）
培养皿Ø100毫米（康宁，目录号：3262）
5ml移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357543）
10 ml移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357551）
1.5ml微管（SARSTEDT，目录号：72.706）
500毫升Nalgene过滤装置-PES FASTER膜 - 0.2微米孔隙度（Dutscher，目录号：029667）
0.22μm过滤器
8周龄老鼠
最低必需培养基（MEM） - 无谷氨酰胺，无酚红，无HEPES（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：51200046）
（来自地衣芽孢杆菌）（Sigma-Aldrich，目录号：31626）
L-谷氨酰胺100x（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：25030024）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
蛋白酶抑制剂混合物（Complete TM，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物）（Roche Diagnostics）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
超纯水
ELISA（Phoenix Pharmaceuticals，目录号：EK-070-47）
下丘脑外植体渗透介质（见食谱）
1 M KCl（见配方）
具有60mM KCl（等渗60mM KCl，50ml）的刺激培养基（参见食谱）

设备

微管支架和15 ml / 50ml锥形管（Dutscher）
P10，P200，P1000移液器（Gilson）
-20°C和-80°C冰箱（Sanyo，VWR）
打孔机（任意固定品牌的任何定孔打孔） -
Carbogen（5％CO 2/95％O 2）（Linde France，UN 3156）
标准图案剪刀，大圈夏普/钝14.5厘米（精细科学工具，目录号：14101-14）
超薄虹膜剪刀，10.5厘米（精细科学工具，目录号：14088-10）
标准图案钳具有锯齿尖（Fine Science Tools，目录号：11000-13）
Dumont＃7镊子弯曲尖端（精细科学工具，目录号：11271-30和11272-30）
2恒温浴（如JULABO，型号：CORIO CD-B27）
渗透室（BIOREP TECHNOLOGIES，目录号：PERI-CHAMBER）
渗透室过滤器（BIOREP TECHNOLOGIES，目录号：PERI-FILTER）
渗透管套（BIOREP TECHNOLOGIES，目录号：PERI-TUBSET）
蠕动泵（高精度多通道泵，Ismatec）
渗透计（LöserMesstechnik，型号：Micro-Osmometer Type 6）

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件）或用于数据统计分析的任何软件

程序

我们在这里描述如何按照这些步骤手动进行下丘脑渗透测定（见图1）：

图1.渗透流程图。在2小时的渗透达到平衡后，抽样程序由30分钟的对照基期，30分钟的时间组成，在此期间药物独立地加入或组合并用培养基洗涤60分钟。在每个实验之后，应用适当的分子（例如，KCl）来控制下丘脑外植体的反应性和测试组织活力。

为整个实验准备足够的下丘脑外植体渗透培养基（参见食谱;准备总是新鲜，不早于前一天，在4℃下储存）。
准备刺激解决方案。例如，我们使用了等渗60 mM KCl（见配方）。
将含有碳原子（5％CO 2/95％O 2）的一些下丘脑外植体渗出培养基预先气化，所有预充气和放气步骤使用碳霉素）在50ml锥形管至少15分钟。大约10ml的预先加入的培养基将用于冷冻用于脑解剖和下丘脑收集，另一部分约40ml将在恒温槽中用温热（34-37℃）进行渗透。 />
使用穿孔机为每个室（每个室2个）准备渗透室过滤器（Biorep）。在室的每个开口端放置一个过滤器（见图2F-2H）。

图2.渗透实验的不同步骤的代表性图像A.将小鼠脑上皮倒置在含有在实验者前面具有下丘脑的冰冷的基础培养基的培养皿中（A，B ，C和D表示步骤8）; B.用手术刀取下小脑; C.用弯曲的Dumont＃7钳子恢复下丘脑; D.在含有冰冷的基础培养基的新培养皿中收集下丘脑（箭头和虚线所示） E.为避免损伤下丘脑，可用大型塑料/玻璃移液器处理; F.在解剖之前，准备渗透室过滤器;显示下丘脑位置的大脑的矢状视图（虚线中的一圈被淹死在下丘脑周围）; H.将一个过滤器放在渗透室的两端（步骤4）;用预热的预先吹入的介质预填充渗透室（如步骤6所述）。 I.将下丘脑置于渗透室的中心（步骤9）。关闭腔室并将其放回37℃的恒温槽中（步骤10）; J.实验装置的完全组装，从右到左依次是在37℃下的恒温槽，其中包含充满渗透介质的管（管与硅管连接成一个一个到渗透室），蠕动泵流入渗透介质，37℃的第二个恒温槽，其接收渗透室（一个渗透室由红色虚线圆圈标记），并且左边，渗出室的出口与硅管连接到低蛋白质吸收将1.5ml微管置于冰上收集级分。渗透介质从右向左流动。
连接适当的管道（低蛋白质吸收管，如特氟龙管），将包含下丘脑外植体的渗出室的入口连接到一侧的蠕动泵，另一侧的腔室出口到管道，用于在另一侧进行部分收集。
用预热的预充气介质预填充渗透室。房间和管道本身将在34-37°C的恒温槽中保存。
对于以前安乐死的每只老鼠（我们使用颈椎脱位选择的方法应该是快速的，以尽可能多地保存组织），切开头部，并将小鼠脑收集在填充有预充气的渗透介质的培养皿中，在冰上冷却。要收集大脑，将一个超薄的虹膜剪刀的底部刀片插入孔中，并开始直接切开并穿过颅骨的中线，小心地将剪刀尖端向上指向。然后，用镊子打开颅骨，向外推动颅骨的两半，从而暴露大脑。仔细翻转颅骨：重力将帮助大脑从头骨脱离。使用Dumont＃7镊子，小心地将镊子沿着脑的外边缘和大脑从嗅角向小脑滑向小脑。轻轻地从任何结缔组织或神经分离大脑，防止它从头骨掉落。
注意：我们使用8周龄的老鼠。用户将确定每个科学项目。限制当然是接收下丘脑的渗出室的体积。
提取下丘脑（见图2A）。将大脑倒置在充满冰冷的浸润培养基的培养皿（即，腹侧朝上，培养皿底部的大脑的可见和背侧）（参见图2A）用手术刀切开小脑和脊髓部分（参见图2B），并使用弯曲的Dumont＃7镊子分离下丘脑（见图2C）：在下丘脑周围仔细深入2毫米，并围绕它们分开，从大脑收集他们。可以在同一道菜中处理多于一个的大脑。收集另一个培养皿中的所有下丘脑外植体（参见图2D），填充在冰上冷却的预先充气的渗透培养基。
一旦收集了所有的下丘脑，就可以将它们立即放在先前填充的渗透室中，这要归功于蠕动泵，有气体和温热的渗透介质（步骤6）。打开房间的一端，轻轻地将海马座放在房间中。注意不要通过使组织粘附在渗出室的一端（，不要将组织靠近腔室的一端或仔细重新定位组织的位置）来阻止渗出物流动房间中心）。关闭渗透室（见图2I）。
注意：我们每个室使用3个下丘脑来增加每个室的肽释放量，以便能够用ELISA量化MCH的释放。应根据实验设置和条件（，感兴趣的神经肽，用于释放该肽的下丘脑的刺激，以及肽量化方法）。
将包含下丘脑外植体的渗出室放入恒温槽（34-37℃），在整个实验过程中保留下来。
浸润性下丘脑外植体在气胸和温暖（34-37°C）浸润培养基下，任何刺激下丘脑之前2 h，以建立下丘脑肽释放的基线水平。用于腔室的入口管被放置在包含渗透介质的瓶子中。进入腔室的渗出介质的流动以蠕动泵以0.1ml / 1分钟的速度设定。这个速率将用于整个实验。
收集基线perifusate的3个部分（每10分钟1次，每次10分钟收集分数）。来自每个室的每个部分将被收集在单独的1.5ml微管中，其中出口管将被预先放置在其中。将收集的1毫升perifusate等分，并尽快在-80℃冷冻以避免肽降解。
一旦收集了基准分数，暂停蠕动泵，以消除在灌注管中引入气泡的风险，并用刺激介质制备管：每个室的入口管应适当放置在相应的预放气和加热刺激溶液再次启动蠕动泵前。
刺激持续不超过30分钟以避免组织的毒性和/或脱敏。在该步骤中，将收集3个级分（1份= 10分钟，将馏分相互收集10分钟）。将收集的1ml过氧化物的级分等分并快速冷冻至-80℃以避免降解。
一旦收集刺激部分，暂停蠕动泵并开始60分钟清洗期：将每个腔室的入口管放入含有气体和温热（34-37℃）下丘脑外植体浸润培养基的瓶子中。在该步骤中，将收集6个级分（1份= 10分钟，将馏分相互收集10分钟）。将收集的1毫升perifusate等分，并尽快在-80℃冷冻，以免降解。
在冲洗后，您可以用适当的刺激再次刺激所有下丘脑外植体，以诱导您的神经肽的释放，以控制下丘脑外植体的活力 - 最大30分钟。在该步骤中，将收集3个级分（1份= 10分钟，将馏分相互收集10分钟）。将收集的1 ml perifusate等分，并在-80°C下冷冻可能避免退化。
关闭泵。下丘脑外植体可以节省进一步分析。外植体采用镊子精细收集，或通过在4℃的微管中离心室（参见Biorep网站的详细信息）。冻在-80°C。
用至少200毫升热压灭菌超纯水彻底清洗整个渗透系统（管道和渗透室）（根据管道材料，泵管应可重复使用20次）。
通过ELISA，RIA，流式细胞仪，质谱法或其他合适的方法定量分泌的神经肽的量/浓度。

数据分析

关于数据处理和分析的所有细节，例如应用的统计测试，数据包含或排除的标准已在2016年的Le Thuc等人公布。

笔记

当酚红不干扰肽定量方法时，可以使用酚红的MEM
对于大脑和下丘脑的收集，尽快进行，以避免组织损伤。
一旦被隔离，必须小心不要损伤下丘脑。我们发现在大直径移液管（COPAN，超大型移液器，207C）的培养基中转运下丘脑是方便的。如方案的步骤9中所述，我们使用每个室3个下丘脑来增加每个室的肽释放量，以便能够用ELISA量化MCH的释放。应根据实验设置和条件（即，感兴趣的神经肽，用于释放该肽的下丘脑的刺激）和肽定量方法来确定下丘脑的数量。
刺激溶液应先用碳水气体放置，并在恒温槽（34-37℃）中温热。放气应处于饱和状态，推荐使用预充气的最短时间为15分钟。我们发现微过滤蜡烛（VWR，参考511-0311）方便气泡溶液与细直径气泡。这些解决方案的起泡和升温开始的时间将取决于被测化合物的性质。例如，含有刺激肽的刺激溶液在使用前最可能不会被加热太久，而含有KCl的刺激溶液可以在方便的情况下预热。此外，应该对分泌的神经肽和所研究的神经元的类型选择刺激。
在刺激期间收集分数时，应注意不要收集渗液管的死体积。死体积对应于在刺激介质渗出之前的灌注腔室和连接管中的常规渗透介质的体积，因此对应于基础条件介质。应该对每个设置进行测量，因为它取决于连接管的长度。在我们的实验条件下，测量为1.2毫升，由于蠕动泵的速度设定为0.1毫升/分，收集的分数延迟了12分钟。
在某些情况下，根据所选择的定量方法和收集的级分中肽的浓度，可能需要一些额外的步骤来改善肽提取或冻干浓缩样品。

食谱

下丘脑外植体渗透培养基（400毫升）
400毫升最低必需培养基 - 无谷氨酰胺，无酚红，无HEPES
4毫升2×10 3 -3杆菌肽（终浓度：20μM）
400毫克BSA
L-谷氨酰胺（终浓度：2μM）
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete TM，不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Roche）1x（1片为50ml→8片）
过滤Nalgene过滤装置中的介质 - PES FASTER膜 - 0.2μm孔隙度
1 M KCl（100 ml）
7.455克KCl（MW = 74.55克/摩尔）
超纯水至100 ml
过滤器在Nalgene过滤装置中PES-PES FASTER膜 - 0.2μm孔隙度
具有60mM KCl（等渗60mM KCl，50ml）的刺激培养基
47 ml下丘脑外植体渗透培养基
3毫升1M KCl 将0.22摩尔过滤的Milli-Q水（Micro-Osmometer Type 6，Löser）将渗透压调节至310-320 mosm，

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金委，“基金会基金会（JLN，DEQ 20150331738和NB和CR”）以及法国政府（国家研究机构ANR）通过“未来投资”的支持。LABEX SIGNALIFE：计划参考＃ANR-11的LabX-0028-01。该协议已经由以前的出版物Callewaere等人（2006）改编自William Rostene博士（法国巴黎研究所）的宝贵帮助。

参考

Callewaere，C.，Banisadr，G.，Desarmenien，MG，Mechighel，P.，Kitabgi，P.，Rostene，WH和Melik Parsadaniantz，S。（2006）。趋化因子SDF-1 / CXCL12通过CXCR4调节血管加压素神经元的发射模式并抵消诱导的加压素释放。 Proc Natl Acad Sci USA 103（21）：8221-8226。

Le Thuc，O.，Cansell，C.，Bourourou，M.，Denis，RG，Stobbe，K.，Devaux，N.，Guyon，A.，Cazareth，J.，Heurteaux，C.，Rostene， Luquet，S.，Blondeau，N.，Nahon，JL和Rovere，C.（2016）。＆nbsp; MCH神经元上的中枢CCL2信号介导代谢和行为适应炎症。 17（12）：1738-1752。

Tolle，V.，Zizzari，P.，Tomasetto，C.，Rio，MC，Epelbaum，J.and Bluet-Pajot，MT（2001）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11174017“target =”_ blank“> 体外和体外生长素释放肽/胃动素相关肽对生长的作用大鼠中的激素分泌。神经内分泌学73（1）：54-61。

Zizzari，P.，Longchamps，R.，Epelbaum，J.and Bluet-Pajot，MT（2007）。 Obestatin部分影响生长激素释放激素对啮齿动物食物摄取和生长激素分泌的刺激。内分泌学 148（4）：1648-1653。 />