设备

用于CRISPR-ERA网站搜索的个人计算机
用于构建全基因组sgRNA库的高性能计算集群。以基因组版本 hg19 为例，最小存储空间为500 G

软件

CRISPR-ERA（ http://crispr-era.stanford.edu/）
USCS基因组浏览器（Kent等人，2002; http：/ /genome.ucsc.edu/ ）
Bowtie2（Langmead 等人，2012; http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml ）
NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ < / a>）
Perl脚本（编程语言， https://www.perl.org/ ）
Shell脚本（编程语言，命令行界面shell， https://www.linux.org/ ）

程序

使用CRISPR-ERA网络服务器进行sgRNA搜索
1. CRISPR-ERA网络服务器输入（图1）
  1. 选择目标基因操作的类型：使用核酸酶进行基因编辑，使用切口酶基因编辑，基因抑制或基因激活。
  2. 选择宿主生物：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酿酒酵母，黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫，，，，，步骤A1a中的不同类型的选择呈现不同的任选生物体
  3. 选择输入格式：官方基因名称，基因位置（基因编辑的目标区域或基因调控的转录起始位点（TSS）位置）或FASTA格式的基因序列（使用文本框或上传文件）。
  注意：通过在每一步的选择框中点击"？"，用户可以找到详细的说明。
  
  图1. CRISPR-ERA输入过程
2. CRISPR-ERA webserver输出（图2）
  
  图2. CRISPR-ERA输出网页
  
  输出网页包含两部分，"查看UCSC基因组浏览器"和"结果"中的结果。
全基因组sgRNA库建设管道
1. 从UCSC基因组浏览器或NCBI网站下载FASTA格式的基因组序列文件和RefFlat或GFF格式的基因组注释文件。以基因组版本 hg19 为例，基因组序列和注释文件可以在 http://hgdownload.soe.ucsc.edu/downloads.html 。
2. 在提交材料传送表单后，可以收到Perl脚本，这样可以使用默认PAM（NGG）序列和模式（N <20> NGG）进行20 bp sgRNA搜索。在搜索步骤中，将记录所有潜在sgRNA靶位点的位置和链信息运行Perl程序：
  
  perl find_all_sgRNA_z_f_c_y.pl hg19_dna.fa out_sgRNA.txt out_sgRNA_fasta.txt out_sgRNA_gc_t.txt out_nag_fasta.txt out_no_sgRNA.txt
  ＃out_sgRNA：所有潜在的sgRNA序列
  > ＃out_nag_fasta.txt：所有具有FASTA格式的潜在sgRNA序列用于bowtie下一步（与out_sgRNA_fasta.txt不同，PAM序列在这里是NAG）
  ＃out_no_sgRNA.txt：每个染色体中的sgRNA序列数。
  
  注意：Perl的帮助信息可以通过命令'perl -h'，'perldoc perl'或 http://learn.perl.org/
3. 运行Bowtie找到所有可能的离靶序列（PAM = NGG，PAM = NAG），每个sgRNA含有高达3-bp的错配。
  
  注意：Bowtie的参数设置可以在 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml 。
4. 通过分析sgRNA序列特征来计算E评分和S评分。 E分是通过GC含量和poly-T存在（仅哺乳动物）计算的，并且基于在步骤B3中导出的偏离目标信息计算S评分。标准可以定制，不同的生物和基因操作有所不同（图3）
  
  图3. E-score和S-score计算的一个例子。序列：GGTGAATGAGGGCTTGCGA。
5. 在基因组注释文件中提取基因TSS位置和编码区。对于基因编辑，sgRNA靶区是编码区。对于基因抑制，sgRNA靶向来自TSS上游-1.5kbp至下游1.5kbp的区域，而目标区域为TSS用于基因激活的-1.5kbp上游。通过在步骤B4中得到的全基因组sgRNA文库中搜索这些区域的合格sgRNA，从而得到所有基因的sgRNA的细节。然后根据额外的目标位置信息更新E-score和S-score分数。图3是Pou5f1抑制的一种sgRNA的E评分和S评分计算实例。以上综合信息形成的不同基因操纵的sgRNA数据库。

数据分析

在找到目标sgRNA序列后，基本步骤是评估每种sgRNA序列的效率和特异性。在本协议中，我们提供了一种在构建全基因组sgRNA文库时计算E评分和S评分的一般方法。对于具体基因操作的sgRNA数据库，除了基因组全长sgRNA文库的标准外，还应包括其他标准，例如用于基因编辑的外显子位置和与TSS进行基因调控的距离。例如，相对于用于基因调控的TSS，效率降低较长。 E-score和S-score的更详细的描述可以在CRISPR-ERA webserver的"帮助"网页上找到（ http://crispr.stanford.edu/help.jsp ）。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（31371341），清华大学计划科学研究计划（20141081175）和东南大学生物电子国家重点实验室开放研究基金的支持。

参考

Doudna，JA和Charpentier，E.（2014）。基因组编辑。基因组工程与CRISPR-Cas9的新前沿。科学 346（6213）：1258096.
Kent，WJ，Sugnet，CW，Furey，TS，Roskin，KM，Pringle，TH，Zahler，AM和Haussler，D。（2002）。 UCSC的人类基因组浏览器 Genome Res 12（6）：996-1006。 br />
Langmead，B.，Trapnell，C.，Pop，M.and Salzberg，SL（2009）。＆nbsp; 新的现有技术：Cas9用于基因激活和抑制。细胞生物学 35（22）：3800-3809。
Liu，H.，Wei，Z.，Dominguez，A.，Li，Y.，Wang，X. and Qi，LS（2015）。＆nbsp; CRISPR-ERA：用于CRISPR介导的基因编辑，抑制和激活的综合设计工具。生物信息学 31（22）：3676-3678。
Qi，LS，Larson，MH，Gilbert，LA，Doudna，JA，Weissman，JS，Arkin，AP和Lim，WA（2013）。＆nbsp; 重复使用CRISPR作为基因表达的序列特异性控制的RNA引导平台。细胞 152 （5）：1173-1183。