材料和试剂

移液器提示
超薄0.5ml离心过滤器3K（默克，目录号：UFC500396）
细胞计数载玻片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450015）
清除胶带
定制20至60个具有游离羧基和氨基末端的氨基酸肽（Pepscan）
自定义Alexa标记的RNA 30核糖核苷酸寡聚体（IDT）
MilliQ水
Alexa Fluor蛋白标记试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A10235）
PEG300（Sigma-Aldrich，目录号：81160）
注意：本产品已停产。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
磷酸二氢钾（K 2/2 HPO 4）
聚尿苷酸钾盐（Sigma-Aldrich，目录号：P9528）
清除指甲油
10倍钾缓冲液，pH 7（参见食谱）

设备

移液器
台式离心机（Eppendorf，型号：5430和5810 R）
trUView比色皿（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702510）
注意：本产品已停产。
SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec Plus）
具有20倍长距离目标（ZEISS，型号：LD Plan-Neofluor 20x / 0.4 Corr Ph2 M27，目录号：421351-9970-000）的LSM 780 Meta NLO共聚焦显微镜（ZEISS，型号：LSM 780 NLO）

软件

禅宗软件（ZEISS）
GraphPad Prism（GraphPad）
Excel（Microsoft）

程序

注意：将MilliQ水中冻干定制肽（Pepscan）的等分试样溶解到1 mM的储备溶液中。将MilliQ水中冻干的定制荧光RNA寡核苷酸（IDT）的等分试样溶解至100μM的储备溶液。将溶解在MilliQ水中的冻干的多尿素钾（Sigma-Aldrich）溶解到10μg/μl的储备溶液中。等分试样储存在-20°C

定制肽的荧光标记
1. 根据制造商的说明书，使用所需的Alexa Fluor标签试剂盒进行标记反应，但使用Amicon Ultra自旋柱纯化肽（最小肽大小必须高于3 kDa）。
2. 在室温下（Eppendorf 5430），以20,817 x g（rcf，最大速度）在台式离心机中加入标记反应并离心10分钟。
3. 丢弃流通。加入400μlMilliQ水，再次离心。重复至少五次，或直到滤液中不再有染料。
4. 吸管剩余溶液，其仍含有来自旋转柱的标记肽，并调节体积以获得500μM-1mM储备溶液。浓度根据初始投入计算。
通过分子挤压诱导精氨酸 - 肽相分离
1. 通过在MilliQ水中将以下试剂严格移液混合以获得所述最终浓度。
  注意：请务必缓慢移液PEG300，并始终使用新的吸头，以防止由于溶液的高粘度引起的错误。
  钾缓冲液（10x储备）至1x（参见食谱）
  PEG300（100％）至30％
  肽（1mM）至所需浓度（1-250μM）
2. 如果肽易于相分离，则溶液在室温下瞬间变为浑浊或不透明。例如参见图2A。在冰上简单冷却可以促进相分离的蛋白质的相分离
3. 通过使用SmartSpec Plus（或类似）分光光度计中的trUView微量滴定板测量60μl样品的OD 600，来量化相分离程度。
  
  图2.肽和液滴形成的实例。A.肽序列和精氨酸含量影响相变;精氨酸以绿色突出显示。 B.通过荧光显微镜观察，RNA和富含精氨酸的肽在相分离时共定位
通过RNA诱导精氨酸 - 肽相分离
1. 通过在MilliQ水中将以下试剂严格移液混合，以获得所述最终浓度：
  钾缓冲液（10x储备）至1x
  PolyU钾盐（10μg/μl）至1μg/μl
  肽（1mM）至所需浓度（1-250μM）
2. 如果肽易于相分离，则溶液在室温下瞬间变为浑浊或不透明。
3. 通过使用SmartSpec Plus（或类似）分光光度计中的trUView微量滴定板测量60μl样品的OD 600，来量化相分离程度。
通过荧光显微镜成像精氨酸 - 肽相分离
1. 如上所述制备相分离的肽溶液。用荧光肽或RNA寡聚体刺激样品，分别达到200nM和100nM作为终浓度
2. 将20μl样品吸入细胞计数载玻片的每个腔室（参见图3）。
3. 使用透明胶带和盖子用指甲油密封腔室，以防止成像期间蒸发（见图3）
4. 让样品在室温下在黑暗中平衡至少30分钟
5. 在LSM 780 Meta NLO共聚焦显微镜上具有20倍长距离目标的图像样本。例如参见图2B。
  
  图3.显微镜室制备的工作流程使用含有蓝色染料的溶液进行说明。步骤1：在孵育室中吸取样品;步骤2：用透明胶带密封室的两侧;步骤3：使用清漆指甲油使得室内气密性牢固。
光漂白后的荧光恢复（FRAP）分析
1. 样品如上所述制备。
2. 在半径为5μM至10μM的液滴的中心，以100％的激光功率漂白半径为1-2微米的圆形区域。建议使用较大的液滴，因此漂白区域不会覆盖整个液滴，从而影响了液滴内扩散的研究。当液滴自发地达不到这个大小时，孵化室在201 x g（rcf; 1000 rpm，Eppendorf 5810 R离心机）上短暂离心30秒。
3. 使用Zen软件在漂白至少60秒后监测荧光恢复（图4A）。
4. 确保同时记录背景溶液和未漂白参考液滴的荧光强度。
5. 将原始数据导出到Microsoft Excel以进行分析。

数据分析

使用Microsoft Excel和Prism进行FRAP数据分析（图4B）。

将原始数据从Zen软件导入Microsoft Excel。
从漂白的液滴和参比液滴中减去背景的荧光强度
从漂白的液滴中减去漂白后第一个时间点的荧光强度。此步骤将第一个漂白后时间点归一化为零。
用漂白后的荧光强度除去漂白液滴的荧光强度。对于参考液滴也是这样做的。这将使漂白前的时间点正常化为1.
用参考液滴的荧光强度除去漂白液滴的荧光强度。这将在时间过程实验期间由于长时间曝光而校正光漂白。
将归一化数据导入GraphPad Prism。
绘制荧光强度作为时间的函数
至少15个液滴的平均FRAP曲线，并使用重复测量方差分析评估多个条件之间的差异

图4.荧光蛋白液滴的FRAP分析。A. FRAP测量的时间序列示例。荧光PR信号在液滴内漂白，随着时间的推移恢复。 B.原始数据归一化概述。步骤1：从禅软件导出的原始数据;步骤2：背景规范化后的数据;步骤3：漂白标准化后的数据;步骤4 + 5：分数归一化和自发漂白校正后的最终数据。步数对应于文本中的数字（数据分析）。

食谱

10倍钾缓冲液

在MilliQ水中制备1 K K 2 2 HPO 4和KH 2 PO 4的储备溶液
将61.5ml 1KH 2 HPO 4+与38.5ml 1M KH 2 PO 4·4结合至100ml 10倍钾缓冲液

致谢

这个协议在Boeynaems等人（2017）中简要描述。研究由欧洲研究委员会（KU Leuven），欧洲研究理事会（VIB），欧洲第七框架计划（FP7 / 2007-2013和ERC拨款协议第340429号），研究基金会佛兰德（FWO）G.0983.14N，比利时科学政策办公室发起的"跨学院吸引力波兰计划"P7 / 16，马拉蒂斯神经肌肉协会（ABMM），ALS Liga（比利时）和"开放未来"基金发起。 S·B·获得了科技创新机构（IWT）的博士研究生奖学金。公厕得到了研究基金会法兰德斯（FWO）的Odysseus G.0029.12补助。

参考

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