材料和试剂

移液器提示（Eppendorf，GBO）
接种环
15-ml聚丙烯离心管（Corning，目录号：430791）
酸洗玻璃珠，直径0.45毫米（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）（见注1）
玻璃巴斯德移液器（Sigma-Aldrich，目录号：Z628018）
20微米具有特氟龙杯（Corning）（Sigma-Aldrich，目录号：Z653527）的Pyrex 玻璃管（见注1）
制造商：Pyrex，目录号：1622 / 10M。
待分析的乳酸克鲁维酵母酵母菌株
- 无水（无水95％）（Sigma-Aldrich，目录号：439177）（参见注1）
HPLC标准麦角甾醇（纯度≥95％）（Sigma-Aldrich，目录号：45480）; 0.3毫克/毫升甲醇储备溶液
酵母提取物（Biolife Italiana，目录号：4122202）
Bacto蛋白胨（Biolife Italiana，目录号：4122592）
D-葡萄糖（Biolife Italiana，目录号：4125012）
氢氧化钾（KOH）颗粒（Merck，目录号：1050331000）
甲醇（CHROMASOLV TM，用于HPLC，≥99.9％）（Honeywell，目录号：24229）
水（CHROMASOLV Plus，用于HPLC）（Sigma-Aldrich，目录号：V270733）
注意：本产品已停产。
YEPD丰富的生长培养基（见食谱）
甲醇KOH溶液（60％KOH，50％甲醇）（见注2和配方）

设备

移液器（Eppendorf，HTL）
孵化器Multitron Standard（Infors HT，Bottmingen，Switzerland）
血细胞计数器
离心机5804R（Eppendorf，型号：5804 R）
高速Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：Digital Vortex-Genie 2，目录号：SI-A246）
自动取样器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：SIL-20AC）
装备有反相C18柱（Ascentis，Express C18，粒径5μm，柱尺寸3×150mm，Supelco）的HPLC仪（Shimadzu Scientific Instruments，型号：Prominence 20A），UV-Vis检测器（岛津科学仪器，型号：SPD-20A）
FastPrep ®细胞匀浆（MP Biomedicals，型号：FastPrep -24，目录号：116004500）

程序

使用接种环将单个菌落的尖端从琼脂平板转移到100ml无菌液体YEPD培养基中（参见食谱）。在振荡器中在28℃下以150rpm孵育培养物达到指数期（1×10 7个细胞/ ml）。通过计数血细胞计数器中的细胞数来监测细胞密度。
通过在室温（RT）下以3,000×g离心5分钟收获细胞，并弃去上清液。
用去离子水（RT）洗涤细胞沉淀，并通过离心（3,000×g，5分钟，RT）收获细胞。
将细胞沉淀物在去离子水（RT）中悬浮至浓度为1×10 9细胞的1ml水中。将1ml细胞悬浮液转移到新的聚丙烯15ml管中
将1ml无菌玻璃珠加入管中，并在冰上冷却3分钟
在2,500 rpm转速下以6 x 60秒的涡旋方式将预先冷却的电池分开，并在断路之间用冰冷却1分钟（见注2）。
将破碎的细胞悬浮液（没有玻璃珠）用玻璃巴斯德移液管转移到具有特氟隆杯的20毫升派雷克斯玻璃管中。
加入3毫升甲醇的KOH溶液，并在70℃下孵育2小时（见注释3和4）
冷却混合物，加入3ml正己烷，并在涡旋混合器上充分混合（10秒）。
在室温下通过在3,000×g离心5分钟分离有机相和水相。/ / em>
将带有玻璃巴斯德移液器的上部有机相转移到带特氟龙杯的干净的派雷克斯玻璃管上
用3ml正己烷重新萃取水相，收集通过离心（5分钟，3000×g，RT）分离的上部相，并加入两个有机相。
在氮气流下从连接的有机相中蒸发正己烷，在室温下进入管中10分钟，3巴。
对于不皂化脂质（甾醇）的HPLC分析，将相当于1×10 9细胞的干脂质提取物溶解在1ml溶剂（例如，n - 己烷或丙酮）（见注5）
使用自动进样器在C18柱上加载10μl等分试样。用95％甲醇和5％水作为流动相分离出麦角甾醇，流速为0.8ml / min。色谱柱温度设置为25°C（见注6）
使用280nm的UV-Vis检测器检测到麦角甾醇

数据分析

峰值同一性来自麦角固醇标准品的保留时间和特征谱（图1）。甾醇的数量可以从为所使用的各个标准构建的校准曲线计算。

图1.甾醇的色谱图（A）标准麦角甾醇（0.8mmol / L）和（B）乳酸克鲁维酵母细胞的甾醇分布（麦角甾醇占酵母总量的80％以上）甾醇）

笔记

脂质提取中使用的所有有机溶剂应具有最高的纯度。在提取过程中不得使用塑料材料（细胞破碎步骤除外）。有机溶剂从塑料中释放出可能会干扰后续分析的添加剂。在整个程序中应使用玻璃和特氟隆®材料。
由于刚性细胞壁，破坏酵母细胞以有效提取脂质是至关重要的。推荐使用FastPrep ®细胞匀浆器（例如，MP Biomedicals）。推荐使用2 x 45秒的断开间隔，并在后续运行中在冰上冷却5分钟。
为了制备10ml甲醇的KOH溶液，推荐将6g KOH颗粒溶解在5ml与2.5ml水混合的甲醇中。当KOH完全溶解时，最终体积应用水调节至10ml。由于反应强烈放热，因此在制备溶液时应特别小心
中性脂质水解的效率取决于甲醇KOH混合物的质量。强烈建议您使用新鲜的溶液。
由于溶剂的高挥发性，脂质提取物总是在氮气流下干燥，并在色谱分析之前立即溶于精确体积的溶剂中。
存在于非皂化脂质提取物中的甾醇源自游离甾醇级分和来自水解的甾醇酯级分。如果HPLC分析不用于制备纯化，则柱温可以提高到40℃，以加速分离过程。
这里提出的HPLC-UV方法可用于各种酵母和可能用于其他类型样品的固醇分析（Valachovic和Hapala，2017）。使用其他固醇的标准，例如，羊毛甾醇，角鲨烯，季戊四醇，有可能确定样品中的数量。

食谱

YEPD丰富的生长培养基
2％D-葡萄糖
1％酵母提取物
2％Bacto蛋白胨
甲醇KOH溶液（60％KOH，50％甲醇）
6克KOH颗粒 5毫升甲醇
H 2 O（蒸馏H 2 O 2）至多10毫升

致谢

该协议由Valachovic和Hapala（2017）进行了改编，并用于我们以前的研究（Goffa等人，2014; Konecna等人，2016年）。这项工作得到了斯洛伐克研究与发展局的批准APVV-0282-10和VEGA 2/0111/15的支持。

参考

Daum，G.，Lees，N.D.，Bard，M。和Dickson，R。（1998）。酿酒酵母脂质的生物化学，细胞生物学和分子生物学。 / a>＆nbsp; 酵母 14（16）：1471-1510。
Dupont，S.，Beney，L.，Ferreira，T。和Gervais，P。（2011）。甾醇的性质影响脱水过程中的质膜行为和酵母存活。 / a>＆nbsp; Biochim Biophys Acta 1808（6）：1520-1528。
Goffa，E.，Balazfyova，Z.，Toth Hervay，N.，Simova，Z.，Balazova，M.，Griac，P。和Gbelska，Y。（2014）。 "KlPDR16"的隔离和功能分析基因。＆nbsp;＆nbsp; FEMS酵母研究所 14（2）：337-345。
Konecna，A.，Toth Hervay，N.，Valachovic，M.and Gbelska，Y。（2016）。 ERG6 基因删除修改乳酸克鲁维酵母对各种生长抑制剂的易感性。＆nbsp; 酵母 33（12）：621-632。
Souza，C.M.，Schwabe，T.M.，Pichler，H.，Ploier，B.，Leitner，E.，Guan，X.L.，Wenk，M.R.，Riezman，I.and Riezman，H。（2011）。有效生产胆固醇而不是麦角固醇的稳定酵母菌对色氨酸有作用吸收，但不是弱有机酸抗性。＆nbsp; Metab Eng 13（5）：555-569。
Valachovic，M.和Hapala，I.（2017）。角鲨烯生产的生物合成方法：酵母的情况。＆nbsp; Methods Mol Biol 1494：95-106。