材料和试剂

移液器提示（可以使用任何标准无菌提示，无过滤或过滤）
ViewPlate-96黑色，光学透明底部（PerkinElmer，目录号：6005225）
组织培养板：Nunc细胞培养培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：172931）
0.22μm过滤器
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）或HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
pMOS-GFP-Grb2质粒（Ketteler等人，2002）
3xFLAG-TACC3质粒（Petschnigg等人，2017）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：61965026）
注意：可以使用任何市售的DMEM，并且可以加入GlutaMax，但HeLa和HEK293T细胞不需要。
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10500056）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
胰蛋白酶/ EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：R001100）
GlutaMax（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：35050061）
四聚甲醛，4％（v / v）（Santa Cruz Biotechnologies，目录号：sc-281692）
注意：应以-20°C储存，以便长期储存。解冻的等分试样可以在4℃下保存长达一个月。
Hoechst 33342三盐酸盐，三水合物，1mg / ml储备液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ，目录号：H3570）
聚乙烯亚胺（PEI），10mg / ml水溶液（Sigma-Aldrich，目录号：408727）
氯化钠（NaCl），AnalaR NORMAPUR（VWR，目录号：27810.295）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
二钠磷酸钠（Na 2 HPO 4），AnalaR NORMAPUR（VWR，目录号：102494C）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
PEI解决方案（见配方）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（参见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

多通道移液器（Finnipipette，8通道P300，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：4661030N）
孵化器（Eppendorf，型号：Galaxy ® 170 R）
高含量筛选显微镜（PerkinElmer，Opera）

软件

ImageJ的

程序

将PEI溶液（见食谱）制成10mg / ml的水。
注意：也可以使用其他转染方法，因为PEI是廉价的，显示出良好的转染效率。
培养在37℃和5％CO 2的补充有10％FBS和青霉素 - 链霉素的DMEM中的HeLa或HEK293T细胞，直到70-80％汇合。
使用多通道移液管（总体积为50μl）胰蛋白酶化细胞并将2×10 4个细胞种子浸入PerkinElmer Viewplate的每个孔中。包括阴性和阳性对照的井（见注3）。对于弱粘附细胞，可能需要用明胶或聚-L-赖氨酸进行预处理。
在37℃和5％CO 2孵育细胞过夜。
在不含FBS和青霉素的DMEM（25μl）中制备100ng GFP-Grb2质粒DNA与100ng cDNA（例如，/或>，3xFLAG-TACC3作为阳性对照或其他对照，参见附注3）的混合物链霉素。
以4：1的比例添加PEI（10mg / ml溶液），即200ng总DNA添加0.8μlPEI。
旋转DMEM / DNA / PEI混合物，并在室温下放置15-20分钟
使用温和分配方法将DMEM / DNA / PEI-混合物滴加到细胞中。
注意：或者，可以将转染混合物首先分配到平板中，然后将细胞添加到顶部（反向转染）。
转染后6 h，用新鲜的DMEM加FBS /青霉素 - 链霉素培养基代替转染混合物。
在37℃和5％CO 2孵育细胞过夜。
第二天，吸出媒体，用1x PBS洗一次细胞（见食谱）。
注意：在此阶段，可以在PBS洗涤前进行诸如EGF刺激或药物治疗的治疗，这取决于孵育的持续时间（例如，10分钟EGF或几小时的药物）。 em>
在PBS中加入50μl4％PFA的PBS，并在室温下孵育10分钟注意：测定也可以在活细胞上进行，在这种情况下可以省略步骤12和13。在这里，我们固定细胞，因为它们可以保存在PBS中几天，并且可以在稍后的时间点对板进行成像。然而，活细胞成像允许更多的实验灵活性，例如延时显微镜。
吸出PFA并用1x PBS洗一次。
加入Hoechst 33342（1x PBS中1:100稀释）10分钟
用1x PBS洗涤细胞一次，加入50μl1x PBS 注意：在这个阶段，板材可以在4°C下储存，直到成像，直到几天。
通过以下设置在合适的荧光显微镜（例如，Opera Phenix）上获取图像：GFP通道488 nm，100％激光功率，40x物镜，合并'1'，曝光时间可能在500之间变化msec和2秒，具体取决于转染效率和亮度。图2显示了Opera-high-content筛选显微镜上的设置。示例图像（TACC3-过表达和AMPH过表达仅与GFP-Grb2相比）如图3所示。
进行图像分析或定性评估图像。

图2.图像采集的仪器设置。 Opera LX图像采集页面的屏幕截图。箭头表示可以调整的设置，包括激光通道，相机，板类型，目标，激光功率，过滤器和曝光时间（从上到下）。其他仪器在布局和设置的设置上有所不同。

图3. GFP-Grb2在TACC3或AMPH过表达时定位的变化示例图。箭头表示易位时的点状结构。刻度棒=20μm。

数据分析

使用免费获得的软件ImageJ分析荧光图像。对于我们的研究，单独分析结构，并通过眼睛评估不同的点状结构。然而，对于高通量屏幕，还可以使用定制的图像分析ImageJ管线来量化结构。更多细节请参见（Ketteler等人，，2017）。或者，可以使用其他软件，如CellProfiler可以使用。典型的高分辨率图像处理工作流程包括降噪，分割和特征提取步骤。通常，用中值滤波器对样本单元的原始核通道进行平滑，用k均值聚类算法进行分割，并选择和量化对象（Ketteler和Kriston-Vizi，2016）。

笔记

该测定是相当鲁棒和可重复的。然而，当进行测定时，确保细胞相当低通过（
转移效率可能在板/孔之间变化，因此稳定的细胞系的产生，例如表达GFP-Grb2的细胞可以改善变异性。如本协议所示，我们共转染了GFP-Grb2和推定的EGFR相互作用因子，如TACC3和AMPH。我们还产生稳定的TACC3细胞系和转染的GFP-Grb2并获得相同的结果。然而，对于大规模筛选实验，我们建议生成GFP-Grb2稳定的HeLa或HEK293T细胞系。
在测定中包括对照以确保易位测定工作是重要的。在这种情况下，阴性对照只是GFP-Grb2（应该显示为胞质模式），也可以包括阳性对照，如过表达TACC3（3xFLAG-TACC3），这应该导致大的点状GFP模式。其他阳性对照可以是已知诱导Grb2从细胞溶质转移的任何蛋白质，例如EGFR，其将Grb2螯合到质膜和/或内体。
该协议描述了易位测定用于筛选应用的用途，因此使用了高通量共聚焦显微镜。可以使用任何（共焦）荧光显微镜进行测定。因此，细胞也可以种植在盖玻片或特殊成像室上。播种后的协议基本相同。
该测定可以适应于背景技术部分所述的更多应用。药物孵育时间，EGF刺激或siRNA / shRNA表达需要由每个用户单独确定。
HeLa和HEK293T细胞均已成功用于我们的检测。然而，应该注意的是，HeLa细胞在96孔板中更容易工作，因为它们在洗涤步骤（4％多聚甲醛固定之前）不倾向于从板上移出。如果使用低粘附细胞，则可以用明胶或聚-L-赖氨酸预处理平板。测定也可以在活细胞中进行，在这种情况下，用户可以省略固定步骤。

食谱

PEI解决方案
在无菌蒸馏水中制备10 mg / ml溶液，并过滤灭菌（0.22μm过滤器），并在4°C下储存
注意：每月准备一次新鲜溶液，以确保转染效率相等。
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
137 mM NaCl
10 mM磷酸盐
2.7 mM KCl
注意：准备10x PBS储存液，用无菌水稀释至1×PBS。
10倍磷酸缓冲盐水（PBS）
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4
2.4g KH 2 PO 4
溶解于800ml蒸馏水中的H 2 O / / 将pH调节至7.4
填写1 L

致谢

这项工作得到英国医学研究委员会向MRC-UCL大学单位（MC_EX_G0800785）提供核心资金和BBSRC RK新研究员奖（BB / JO / 5881/1）的支持。 JP获得了EC-Marie Curie International Incoming Fellowship（FP7-PEOPLE-2013-IIF）的支持。该协议已经从（Petschnigg等人，2017）改编。

参考

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Freeman，J.，Kriston-Vizi，J.，Seed，B.and Ketteler，R。（2012）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih （68）。
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