材料和试剂

1.5 ml微量离心管
玻璃试管（IWAKI，目录号：A-18P）
双面胶带（NICHIBAN，目录号：NW-5）
24 x 32毫米盖玻片（厚度：0.12-0.17毫米）（松本玻璃，目录号：C024321）
18×18毫米盖玻片（厚度：0.12-0.17毫米）（松本玻璃，目录号：C018181）
移液器提示
滤纸（Toyo Roshi Kaisha，ADVANTEC，目录号：00011090）
沙门氏菌 YVM1004菌株（pH5.R）-fliG ）（Morimoto等人，2011）
沙门氏菌 YVM1049菌株（ΔFiH-fliI flhB）（P28T）pHluorin（M153R）-fliG ）（Morimoto等人， em>，2016）
沙门氏菌 SJW1103菌株（运动性和趋化性的野生型）（Yamaguchi等人，1984）
沙门氏菌 SJW1368菌株（Δ（cheW-flhD）;鞭毛主操纵子突变体）（Ohnishi等人，1994）
pYVM008（pTrc99A / pHluorin（M153R）-FliG）（Morimoto等人，2016）
PBS中纯化的pHluorin（M153R）-FliG-His6蛋白质
注意：通过镍 - 次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析从过表达pHluorin（M153R）-FliG-1的大肠杆菌BL21（DE3）细胞的可溶性级分纯化pHluorin（M153R）-FliG-His蛋白质，他由Minamino等人（2000）。
氨苄青霉素钠盐（和光纯药，目录号：014-23302）
格列美星（Thermo Fisher Scientific，目录号：G6888）
苯甲酸钾（和光纯药，目录号：164-19342）
Bacto胰蛋白胨（BD，Bacto TM ，目录号：211705）
酵母提取物（BD，Bacto TM ，目录号：212750）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-13925）
Bacto琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214010）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-22635）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（和光纯药工业公司，目录号：164-04295）
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸二钠盐二水合物（2NA）（EDTA）（Dojindo，目录号：N001）
LB培养基（见食谱）
TB介质（见配方）
LB琼脂平板（参见食谱）
运动缓冲（见配方）

设备

pH计（Beckman Coulter，型号：Φ34）
摇动培养箱（30℃，200rpm）（TAITEC，型号：BR-40LF）
分光光度计（能够测量OD 600）（Shimadzu，型号：UV-1800）
离心机（能够容纳1.5ml管，以6,000xg旋转）（TOMY SEIKO，型号：MX-305）
单通道移液管（1000μl，100μl）（PIPETMAN Classic; Gilson，型号：P1000和P100）
倒置荧光显微镜（Olympus，型号：IX71）（见图1）

150x油浸物镜（Olympus，型号：UApo150XOTIRFM，NA1.45）
电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（Hamamatsu Photonics，型号：C9100-02）
激发滤波器（Omega Optical，型号：400AF30）
励磁过滤器（Olympus，型号：BP470-490）
发射滤光片（Omega Optical，型号：520DF40）
高速波长切换器（Sutter Instrument，型号：Lambda DG-4）
分色镜（Semrock，型号：FF510-Di01-25x36）

软件

MetaMorph（Molecular Devices）
ImageJ（National Institutes of Health， https://imagej.nih.gov/ij/ ）
IGOR Pro（WaveMetrics）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

注意：除非另有说明，所有程序均在室温下进行。

荧光显微镜
1. 从LB琼脂板上挑选表达pHluorin（M153R）-FliG（YVM1004和YVM1049用于局部pH测量和用pYVM008转化的SJW1368进行体内校准）的单个菌落细胞<并用5ml LB接种到玻璃试管中，在30℃下以150rpm摇动过夜。当生长SJW1368 / pYVM008细胞时，加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/ ml。
2. 将50μl过夜培养物转移到5ml新鲜的TB中，并在30℃下以150rpm摇动孵育直到细胞密度达到约600的OD 600。 1.8。
  注意：大约需要15小时。
3. 转移500μl每种培养物至1.5 ml微量离心管，然后通过离心（6,000 x g，2分钟）收集细胞。
4. 弃去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于1.0ml运动缓冲液中
6. 以6,000 x g离心2分钟。
7. 弃去上清液。
8. 重复步骤A5-A7两次。
9. 将细胞重新悬浮在500μl新鲜运动缓冲液中。
10. 通过将双面胶带夹在24 x 32毫米的盖玻片（底侧）和18 x 18毫米的盖玻片（上侧）之间进行隧道滑动（见视频1）。
  
  Video 1. Preparation for a tunnel slide (from Morimoto et al., 2017)
11. 将50μl细胞悬浮液加入隧道载玻片上，放置5分钟，将细胞连接到盖玻片表面。
12. 通过使用移液管（P100）提供100μl动力缓冲液清洗未结合的细胞。用一张滤纸吸收多余的缓冲液。（见视频1）
13. 将样品放在定制的倒置荧光显微镜上（图1）
  
  图1.使用比例pHluorin（M153R）的pH成像系统的示意图。 pH成像系统建立在具有150x油浸物镜，1.6x可变插入物和C9100-02 EMCCD相机的倒置荧光显微镜上。通过具有两个激发滤光器的氙灯（用于410nm激发的400AF30（Omega Optical））和用于470nm激发的BP470-490（Olympus））激发pHluorin（M153R）-FliG的荧光斑点。使用高速波长切换器来切换这两个激励滤波器。荧光发射通过分色镜（DM）（FF510-Di01-25x36，Semrock）和发射滤光片（EmF）（520DF40，Omega Optical）。每个荧光图像被EMCCD相机捕获。高速波长切换器和EMCCD摄像机由MetaMorph软件控制。 ND：中性密度滤光片。
14. 选择150x物镜并插入1.6x可变镜头。
  注意：需要高倍率来测量活细菌细胞中的局部细胞质pH（150x物镜和1.6x可变透镜，C9100-02CEMCD [单元尺寸：8×8μm]：33nm /像素）。 em>
15. 使用高速波长切换器在410和470 nm的激发滤波器之间切换
16. 通过EMCCD照相机以5秒的曝光时间捕获pHluorin（M153R）-FliG荧光斑点的每个图像（图2）。
  注意：
校准
1. 步骤A8：将携带pYVM008的SJW1368细胞重悬于含有20μM短杆菌肽和20mM苯甲酸钾的500μl动力缓冲液中。
2. 将50μl细胞悬浮液加入隧道载玻片，放置5 min
3. 通过提供100μl含有20μM短杆菌肽和20mM苯甲酸钾的运动缓冲液来清洗未结合的细胞。使用滤纸吸收过量的缓冲液。
4. 将样品放在荧光显微镜上
5. 在20μM短杆菌肽和20mM苯甲酸钾的存在下，在外部pH 6.0,6.5,7.0或7.5的条件下获得细胞的比例荧光图像。每次外部pH测量时，隧道载玻片和细胞都是新鲜准备的。
校准
1. 在不同pH值5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0或8.5的运动缓冲液中悬浮纯化的pHluorin（M153R）-FliG蛋白。
2. 加入50μl含有pHluorin（M153R）-FliG蛋白的溶液到隧道载玻片上，并用一张滤纸吸收多余的溶液。
3. 获得在每个pH值下由410和470nm激发的pHluorin（M153R）-FliG蛋白溶液的荧光图像。
  注意：当pH值（M153R）-FliG的蛋白质浓度太高时，其荧光强度相当高，从而使EMCCD相机的传感器芯片饱和。因此，有必要将pHluorin（M153R）-FliG的蛋白质浓度调节至约〜100μg/ ml，以便进行体外校准曲线。

数据分析

通过图像分析软件IGOR Pro或ImageJ分析荧光图像。

校正曲线
1. 定义由携带pYVM008的SJW1368细胞的图像分布确定的细胞体的总荧光强度（图3）。
  注意：由于flhDC缺失菌株不产生鞭毛，所以pHluorin（M153R）-FliG探针在细胞质中自由扩散。
  
  图3.通过pHluorin（M153R）-FliG测定细胞质体积pH的典型图像过程。详见文本。
2. 将工具背景强度定义为附近无细胞区域的50 x 50像素ROI（感兴趣区域）内的平均像素强度。
3. 将自发荧光强度定义为不产生荧光蛋白的50种野生型SJW1103细胞的平均像素强度。
4. 从荧光细胞体的总荧光强度减去细胞的仪器背景和自发荧光，以定义在410和470nm激发波长下自由扩散pHluorin（M153R）-FliG的荧光强度。
5. 计算pH值荧光素（M153R）-FliG探针的荧光强度比（R 410/470）。
6. 从20μM的短杆菌肽和20mM的苯甲酸钠存在下，在每个外部pH下得到的pHluorin（M153R）-FliG的R 410/470的R p值确定细胞质pH，两者平衡了内部和外部的沙门氏菌细胞内的pH，以使体内校准曲线（图4）。
  注意：体内校准清楚地表明，pHluorin（M153R）-FliG可作为活细胞中的pH指示剂。
  
  图4.体外的pHluorin（M153R）-FliG在体外的校准曲线。通过pH成像系统在5.5至8.5的pH范围内摄取纯化的pHluorin（M153R）-His蛋白质溶液的荧光图像。在每个pH值（黑色，体外）下计算荧光强度比410/470，并且通过乙状结肠功能拟合数据。然后，在20μM短杆菌肽和20mM苯甲酸钾的存在下，在四种不同pH值，6.0,6.5,7.0和7.5的运动缓冲液中，通过相同的体系观察携带pYVM008的SJW1368细胞并测量细胞内pH（体内橙色）。垂直条表示标准偏差（从Morimoto等人修改，2016）。
7. 在减去仪器背景强度后，定义纯化的pHluorin（M153R）-FliG蛋白的荧光强度，作为不含荧光蛋白的溶液图像的100×100像素ROI内的平均像素强度。
8. 在每个pH值下计算纯化的pHluorin（M153R）-FliG的R 410/470。
9. 绘制发射强度比值作为pH值的函数，以在5.5至8.5的pH范围内进行体外校准曲线（图4）。
10. 使用IGOR Pro软件通过S形曲线功能调整校准数据。
局部pH值的测定
1. 对于YVM1004细胞的荧光图像，将20×20像素的pHluorin（M153R）-FliG的荧光斑点应用于ROI的图案（图2）。
2. 从每个像素值减去包括工具背景和单元格自动荧光的总背景强度。仪器背景强度定义为邻近无细胞区域的50 x 50像素ROI内的平均像素强度。细胞的自发荧光强度定义为非荧光细胞SJW1103的ROI内的平均像素强度。
3. 定义pHluorin（M153R）-FliG探针的单个荧光斑点的荧光强度作为ROI内的积分荧光强度值。
4. 计算在410和470nm激发波长的pHluorin（M153R）-FliG斑点的荧光强度的比例。
5. 使用体外校准曲线确定每个荧光斑点的R 410/470值的局部pH值。
6. 使用Microsoft Excel（Microsoft），从100多个荧光斑点的数据计算局部pH值的平均值和平均值的标准误差（图5）。
  
  图5.使用pHluorin（M153R）-FliG测量局部pH。 pH-fliG（YVM1004）的鞭毛III型蛋白质输出装置周围的局部pH值和pH值（P28T）的pH-测量fliG （YVM1049）细胞。分析了300多个荧光斑点。垂直条表示标准错误（从Morimoto等人修改，2016）。

笔记

由于需要足够的荧光强度以检测局部pH，所以表达pHluorin（M153R）-FliG的细胞应在振荡下孵育超过5小时才能使pHluorin（M153R）的荧光团完全成熟。

食谱

LB培养基（每升）
10克Bacto胰蛋白胨
5克酵母提取物
5克NaCl
TB培养基（每升）
10克Bacto胰蛋白胨
10mM磷酸钾，pH7.0
LB琼脂板
LB培养基
1.5％Bacto琼脂
运动缓冲区
10 mM磷酸钾
0.1 mM EDTA
调整为不同的pH值：5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0或8.5

致谢

该协议是从以前的工作（Morimoto等人，2016）修改的。该研究部分由JSS KAKENHI Grant Numbers JP15K14498和JP15H05593给予YVM，JP25000013至KN和JP26293097至TM，以及MEXT KAKENHI Grant Numbers JP26115720和JP15H01335至YVM和JP24117004，JP25121718和JP15H01640至TM。

参考

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