材料和试剂

手套，面具和实验室外套
移液器提示
10μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-207℃）
200μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-705℃）
1毫升（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-706C）
27 G针（Terumo Medical，目录号：NN-2732R）
24孔组织培养板（Greiner Bio One International，CELLSTAR ，目录号：662160）
尼龙纤维柱T（和光纯药，目录号：147-06721）
21 G针（Terumo Medical，目录号：NN-2138R）
尼龙网，70μm（AS ONE，目录号：PA-70μ）
文化盘
3.5 ml（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：627170）
10 ml（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：664160）
BD Falcon ®一次性转移移液管，3 ml（Corning，Falcon ®，目录号：357524）
10 ml血清移液管（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：607180）
Falcon ®将15ml锥形离心管（Corning，Falcon ®，目录号：352097）
1.5毫升圆底微管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-715C）
铝箔（三菱）
C57BL6 / Nslc（B6）小鼠
70％乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：324-00037）
坠冰和载体
重组鼠GM-CSF（PeproTech，目录号：315-03）
重组鼠IL-4（PeproTech，目录号：214-14）
重组小鼠IFN-γ（PeproTech，目录号：315-05）
EndoGrade ®无内毒素卵白蛋白（Hyglos，目录号：321000）
蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15230162）
磷酸缓冲盐水（PBS; 10x），pH7.2（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：70013073）
CellTrace TM紫细胞增殖试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C34557）
CellTrace TM CFSE细胞增殖试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C34554）
APC抗小鼠CD4抗体（BioLegend，目录号：100516）
APC大鼠IgG2a，κ同种型Ctrl抗体（同种型）（BioLegend，目录号：400511）
PE抗小鼠CD8a抗体（BioLegend，目录号：100708）
PE大鼠IgG2a，κ同种型Ctrl抗体（同种型）（BioLegend，目录号：400507）
RPMI-1640（和光纯药，目录号：189-02025）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
100x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：10378016）
100x MEM非必需氨基酸溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140）
100mM丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360070）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
完成培养基（见食谱）

设备

三洋生物洁净台（松下医疗保健，目录号：MCV-B131F）
CO 2培养箱（Panasonic Healthcare，目录号：MCO-5ACUV-PJ）
高压灭菌器（TOMY SEIKO，型号：ES-315）
镊子（Weller，目录号：4SA）
离心机（Beckman Coulter，目录号：Allegra X-12）
水浴（东京Rikakikai，EYELA，型号：NTT-2000）
解剖仪开始设定（NATSUME SEISAKUSHO，Nazme，目录号：E-16-F）
流式细胞仪（Beckman Coulter，型号：Gallios）

软件

FlowJo V.10.0.8。（FlowJo，LLC）

程序

树突状细胞（DCs）培养和抗原加载（图1）
1. 将C57BL6 / Nslc（B6）小鼠保持在CO 2室中5分钟，并确认死亡。股骨和胫骨骨皮质两端均用27 G针刺。通过一端的孔注入5ml PBS，从另一端的孔收集骨髓细胞（BMC）。约5-8 x 10 7 可以从一只小鼠收集BMC。在GM-CSF（10ng / ml），IL-1β的存在下，在1ml完全培养基（见Recipes）中，将BMC在24孔TC板中培养1×10 6个细胞/孔， 4（10ng / ml）在5％CO 2 /空气中在37℃。
2. 在第2天，除去培养汤，并向板中加入新的GM-CSF（10ng / ml），IL-4（10ng / ml）的完全培养基（0.5ml /孔）。将培养汤离心（300×g，5分钟，22℃），将上清液加回板中（每孔0.5ml）。
3. 在第5天，收获细胞并用PBS洗涤2次。分流比约为60-80％。在GM-CSF（10ng / ml），IL-4（10ng / ml）存在下，将细胞在1ml完全培养基中，每孔1×10 6个/孔/ ml）和IFN-γ（10ng / ml）。最终体积为1ml /孔。
4. 在第6天，细胞用OVA（400μg/ ml）脉冲24小时。详细地，首先用100μg/μl的PBS稀释OVA，然后以4μl/孔加入到DC中。最终体积为1.004ml /孔。至少2口细胞未用OVA作为阴性对照进行反应。
5. 细胞在第7天被收获。因为感兴趣的细胞松散粘附，我们1）轻轻地敲击板; 2）收获液体; 3）用1ml PBS冲洗空孔并收集流体。将收获的细胞用PBS洗涤三次，以确保彻底去除多余的OVA。将细胞以每30μl1.5-4.5×10 5个/ ml悬浮于PBS中（图1）。
  
  图1. OVA脉冲DCs制备从B6小鼠中分离骨髓细胞，并在含GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养7天。在第2天改变半/半培养基。在第5天用IFN-γ刺激BM-DC 48小时，并在第6天用OVA脉冲24小时。细胞在第7天收获，并在使用前彻底清洗。
T细胞制备
1. 脾从OT-1和OT-2 Tg小鼠分离。脾细胞在4.5ml蒸馏水中溶血6秒，然后加入0.5ml 10x PBS。之后，加入5ml 1x PBS稀释悬浮液。
2. 使用尼龙柱T分离脾T细胞。尼龙柱T缓慢用10ml预热的RPMI-1640洗涤。通过挤压尼龙纤维除去空气。将溶血的脾细胞（<1×10 8）悬浮在1ml温的RPMI中并加载到柱上。将连接色谱柱和21 G针的T型旋塞旋转，使悬浮液浸入尼龙纤维中，然后将1ml额外的RPMI-1640装载到柱上。然后，将柱密封并在37℃和5％CO 2下孵育60分钟。之后，用5ml温热RPMI洗脱T细胞
3. 根据产品手册，T细胞用CellTrace Violet或CFSE细胞增殖试剂盒（2.5μM，37℃，8分钟）标记。将紫色或CFSE标记的T细胞以3×10 6 /500μl/500μl悬浮于PBS中用于使用。详细信息如图2所示
  
  图2. T细胞分离和标记。脾细胞用蒸馏水和10x PBS溶血。 T细胞由尼龙羊毛柱分离，然后用Cell-Trace CFSE或紫色标记。
al淋巴结检测（PLNA）
1. 紫外线或CFSE标记的OT-1或OT-2 T细胞在第-1天以3×10 6 /500μl/小时静脉内转移到幼稚的B6小鼠（受体）。然后将OVA脉冲BMDCs在第0天以4.5×10 5 /0.03ml皮下注射到受体的脚垫中。在第3天收获po淋巴结（PLN）。
2. 淋巴结（LN）胶囊被27 G针刺穿。用70μm筛网过滤从LN分离的细胞，用CD8-PE（紫色标记的T细胞组）或CD4-APC（CFSE标记的组）染色用于流式细胞术评估。详细信息如图3所示
  
  图3.PLNA程序。步骤1.细胞标记的T细胞在第-1天转移到宽型B6中。将OVA负载的DC在第0天皮下注射到其脚垫中。在第3天收获po淋巴结（PLN）。步骤2.从PLNs收获的细胞用抗体染色并通过流式细胞术检测。

数据分析

通过Gallios流式细胞仪检测从PLN分离的细胞，并用FlowJo V.10.0.8进行分析
通过在CD8 +（OT-1）或CD4 +（OT-II）群体上门控的紫罗兰或CFSE稀释来测定T细胞的增殖。灰线表示PBS注入足垫（i.fp），用作阴性对照（图4）

图4. PLNA数据。 CD8 + Violet + （OT-1）或CD4 + CFSE + （OT-II）双正数人口选择直方图视图。 T细胞转移+ PBS i.fp，阴性对照组（灰色）表示原始的不扩散群体。增殖群体门控并显示为总T细胞的百分比。

食谱

完全介质（500 ml）
435 ml RPMI-1640
50ml Gibco TM 胎牛
5 ml 100x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺
5 ml 100x Gibco MEM非必需氨基酸
5毫升100毫摩尔Gibco 丙酮酸钠
2μl2-巯基乙醇

致谢

这项研究得到了国家儿童健康与发展中心（26-6,26-27和27-21），日本教育，文化，体育，科技部的研究资助（赠款15F15756和15K10043）。

参考

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Zhang，Q.，Ichimaru，N.，Higuchi，S.，Cai，S.，Hou，J.，Fujino，M.，Nonomura，N.，Kobayashi，M.，Ando，H.，Uno， Sakurai，K.，Mochizuki，S.，Adachi，Y.，Ohno，N.，Zou，H.，Xu，J.，Li，XK和Takahara，S。（2015）。使用CD40 siRNA永久接受小鼠心脏同种异体移植以诱导调节性骨髓细胞通过使用新型多糖siRNA递送系统。＆nbsp; Gene Ther 22（3）：217-226。