材料和试剂

Biospin 6柱（Micro Bio-Spin＆lt; sup＆gt; P-6凝胶柱，Tris缓冲液）（Bio-Rad Laboratories，目录号：7326222）
细胞培养12孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：150628）
18毫米直径的圆形玻璃盖玻片（Gerhard Menzel，目录号：CB00180RA1）
15 ml管
PCR管
Parafilm M
软纸组织
手套
显微镜玻璃片
2 ml管
真空过滤（例如，真空过滤系统，标准生产线）（VWR，目录号：10040-436）
0.2μm注射器过滤器
转移移液管
图1所示的图像来自与人类的适配体：
EGFR（5'-SH-EGFR aptamer-3'，seq＃2369-27-02，50mer）
ErbB2（5'-SH-ErbB2 aptamer-3'，seq＃1194±35,40mer）
Epha2（5'-SH-EphA2 aptamer-3'，seq＃2176-01-01,76 mer）
注意：它们由韩国的Aptamer Sciences，Inc.生产，由欧洲的AMS生物技术公司提供。所有三个适体在不出现的位置含有化学修饰5-（N-苄基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷（5-BzdU）。
三乙基乙酸铵缓冲液pH 7.0,1M（TEAA）（AppliChem，目录号：A3846）
马来酰亚胺Atto647N染料（Atto-TEC，目录号：AD 647N-41）
无水二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
氯化钠（NaCl）
乙醇
1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（1x DPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
乙腈
胰蛋白酶-EDTA溶液（Lonza，目录号：17-161E）
超纯DNA酶和无RNA酶的蒸馏水（Carl Roth，目录号：T143.2）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）
氢氧化钠（NaOH）
DMEM，高葡萄糖培养基，无谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11960044）
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S 0615）
L-谷氨酰胺200mM（Lonza，目录号：BE17-605E）
青霉素/链霉素10,000 U / ml，各（Lonza，目录号：17-602E）
RPMI 1640培养基，无谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21870076）
聚-L-赖氨酸（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P5899-5MG）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
氯化钾（KCl）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）
鲑精子DNA，剪切，10mg / ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9680）
硫酸葡聚糖钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：31404）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
Mowiol ®（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
1M Tris（2-羧乙基）膦盐酸盐储备溶液（TCEP）（参见食谱）
完成DMEM培养基（见食谱）
完成RPMI培养基（见食谱）
聚-L-赖氨酸（PLL）储备溶液（参见食谱）
5x磷酸缓冲盐水（5x PBS）（参见食谱）
25mM MgCl 2溶液（5x MgCl 2）（参见食谱）
阻塞解决方案（见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
淬火液（见配方）
Mowiol ®（请参阅食谱）
（可选）缓冲区A（请参阅配方）
（可选）缓冲区B（请参阅配方）

设备

微量离心机（例如，，Eppendorf，型号：5415或类似物）
Nucleosil 100-5 C18色谱柱
（可选）Dionex DNAPac PA200 4 x 250 mm色谱柱
血细胞计数器
细胞培养罩
热循环仪
铝金属板（长x宽x厚[cm]：例如，20×12×2）
细胞培养箱
半弯钳
烤箱
STED显微镜，Leica脉冲STED设置由真实共聚焦系统（TCS）STED SP5（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP5）荧光显微镜组成，荧光显微镜配备有100x 1.4 NA HCX PL APO油物镜（Leica Microsystems，德国） >
脉冲激光（PicoQuant，德国）
蓝宝石可调激光（迈泰宽带，光谱物理，美国）
玻璃烧杯
磁力搅拌器
实验室外套，眼睛护理

软件

ImageJ（ http://imagej.nih.gov/ij/ docs / index.html ）
MATLAB（MathWorks，马萨诸塞州，美国）

程序

染料与适体偶联
在该步骤期间，进行硫醇 - 马来酰亚胺交联反应以使荧光团与适配体缀合。或者具有3'-氨基的适体可用于与NHS酯（例如，Atto647N NHS-酯）的进一步缀合。一些荧光标记的适体也可商购。
1. 在100μl0.1M TEAA中加入10nmol硫醇的适体与10mM Tris（2-羧乙基）膦溶液（TCEP;参见方案1）。将管在70℃加热3分钟，并将混合物在室温下孵育1小时
2. 根据制造商的说明书，在Biospin 6柱上通过尺寸排阻色谱法除去此反应。
3. 加入还原适体（来自步骤A2）将4μl10μg/μl马来酰亚胺官能化的Atto647N（预先溶于DMSO中），并通过移液或涡旋混合内容物。
4. 在4℃下孵育过夜。
5. 通过乙醇沉淀回收荧光团标记的适体：加入100μl300mM NaCl和450μl冷乙醇，通过倒置封闭样品几次仔细混合，并将样品在干冰中冷冻20分钟（或-20℃，数小时），在4℃下以15,000 xg（rcf）离心30分钟，弃去上清液，并将沉淀物在50μl的70％乙醇中洗涤。
6. 重悬于50μl1x DPBS中，并在Biospin 6柱上脱盐1次DPBS
7. 测量260 nm和650 nm的吸光度比
8. 在Nucleosil 100-5 C18 4 x 250 mm柱上使用0-40％乙腈在TEAA缓冲液中的梯度在30分钟内通过反相HLPC（例如）确认标记效率和游离染料不存在在30℃下的流速为1ml / min）或通过阴离子交换HPLC（例如，使用0-75％缓冲液B的梯度的Dionex DNAPac PA200 4×250mm柱）（参见配方12）在40分钟的缓冲液A（参见食谱11）中，流速为1ml / min，在60℃。
9. 将标记的适体样品储存在-20°C直至使用。
染色前的细胞培养准备含有感兴趣受体的细胞系（和缺乏它的细胞系，用作阴性对照）应在适配体染色前一天接种到含有聚-L-赖氨酸（PLL）的包被盖玻片的12孔板中。根据细胞系，选择适当的细胞编号（使用血细胞计数器计数细胞），在12-16小时孵育后达到约70-80％汇合。下面描述的整个过程必须在细胞培养罩下的无菌条件下进行。
1. 将HeLa（Epha2a阳性）细胞在完全DMEM培养基（参见方案2）和A-431（EGFR阳性）和SKBR3（ErbB2R阳性）细胞在完全RPMI培养基中培养（参见方案3）生长在平板中。所有细胞系保持在37℃和5％CO 2
2. 为了分裂细胞，首先用无菌的1x DPBS洗涤细胞，加入2-3ml胰蛋白酶-EDTA以覆盖板的表面，并在37℃下孵育板1-5分钟或直到细胞完全分离。加入10毫升完整的DMEM培养基或RPMI培养基以灭活胰蛋白酶。轻轻吸取含有灭活胰蛋白酶的培养基，将所有细胞从板上分离，并将其转移到无菌的15 ml管中。
3. 在室温下以1,000rpm（〜250×g×g）离心细胞4分钟。
4. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于10ml完全DMEM培养基/ RPMI培养基中。在新鲜的完全DMEM或RPMI培养基中稀释悬浮的细胞至所需浓度，并向含有PLL处理的盖玻片的12孔板的每个孔中加入1ml（用于PLL储备溶液制备和稀释，参见方案4）。将板在37℃和5％CO 2孵育直到染色。
功能适体的制备：折叠反应
在该步骤中，适体以适当的镁浓度暴露于高温，这允许它们在染色程序之前获得适当的折叠。为了获得更好的效果，折叠反应应在染色前每次新鲜进行。在开始折叠反应之前，准备在1x DPBS中稀释适体的储备溶液至终浓度为30μM，并保存在4°C的光照条件下。
1. 通过混合3.3μl荧光标记的适体（30μM适体储备溶液），2μl5x PBS（参见方案5），2μl5x MgCl 2（2），制备10μl10μM功能适体食谱6）和2.7μl超纯DNA酶和无RNA酶的蒸馏水。请注意，该反应应在适合热循环仪的PCR管中进行。
2. 将适体溶液加热至75℃3分钟，然后使用热循环仪以1℃/ min的速率冷却至20℃。
适体活细胞染色
1. 从程序B中制备的细胞吸出培养基，根据细胞系，用完全的DMEM或RPMI冲洗一次，并在37℃和5％CO 2（细胞培养物）中孵育10分钟培养箱），500μl/孔新鲜制备的含有剪切的鲑鱼精子DNA和硫酸葡聚糖的封闭溶液（参见方案7）。
2. 同时，准备用于37℃染色/培养的金属板。用胶带固定一块Parafilm ®（足够大以适合所有盖玻片被染色）（见视频1），并预热含有Parafilm ®的金属板， / sup> M在细胞培养箱中。
  
  Video 1. Aptamers live staining part I. This video shows the metal plate preparation for aptamer live staining. Please note that this video is for demonstration only and that this step should be performed inside a cell culture hood.
3. 封闭后（步骤D1），使用半弯钳剔除12孔板上的盖玻片，用柔软的纸巾轻轻敲打盖玻片的边缘，取出多余的封闭溶液，将盖玻片倒置在60 点样固定在金属板（步骤D2中制成）的Parafilm固定体上（参见视频）（见视频），将染色溶液（完全补充有100μg/ ml剪切的鲑鱼精子DNA和250nM折叠适体的DMEM）2）。在37℃和5％CO 2下孵育细胞60分钟。
  
  Video 2. Aptamers live staining part II. This video shows removal of coverslips containing cells from the 12-well plates using half-curved-forceps and incubation of cells (on coverslips) with staining solution. Please note that this video is for demonstration only and that this step should be performed inside the cell culture hood. To avoid contamination, gloves should be sprayed with 70% ethanol.
4. 孵化后，用半弯钳仔细将盖玻片从金属板上取下，用柔软的纸巾轻轻敲打盖玻片的边缘去除多余的染色溶液，然后大量淹没数次（< 例如，20-40ml在一个小烧杯中）的冰冷的1×DPBS。通过将它们轻敲掉在薄纸上，并将每一个（细胞侧向上）放入装有1ml /孔冰冷的4％PFA的新的12孔板的孔中，从盖玻片上简单地除去多余的1x DPBS（见配方8）进行固定（见视频3）。
  
  Video 3. Aptamers live staining part III. This video shows the washing step after staining procedure. Please note that video is in open air for demonstration only and that 4% PFA should only be handled in the fume hood.
5. 在冰上将细胞固定20分钟，然后在室温下再静置25分钟。固定期间，保护板免受光照，避免荧光团漂白
6. 吸出PFA溶液，并向每个孔中加入1ml淬灭溶液（参见食谱9）。在室温下孵育15分钟，防止光照。
7. 用1x DPBS（1ml /孔）洗涤两次5分钟，并用Mowiol ®（参见配方10;例如）安装盖玻片，8-9μl，用于18mm盖玻片）在显微镜玻璃片上
8. 将安装的盖玻片在37℃的烘箱中干燥20-30分钟或在室温过夜，并保存在4℃，免受光照直至成像。

数据分析

成像：使用100x 1.4 NA HCX PL APO油物镜获取本协议（图1）所示的图像。用635nm脉冲激光（PicoQuant，Germany）激发Atto647N荧光团，并用脉冲红外钛：蓝宝石可调激光器（Mai Tai Broadband，Spectra-Physics，USA）获得750nm消耗的STED光束。像素大小设置为20.2nm，扫描速度为1kHz，线平均为96次，针孔为1个艾里单位，信号用雪崩光电二极管检测器（APD）检测。

图1.适体或抗体染色细胞中的内体样结构的识别A.A STED图像比较用适体和抗体染色的细胞与相同受体（Ab1和Ab2）在饱和条件下，如（Gomes de Castro等人，2017）。箭头指向一些内体样结构的实例，使用抗体进行染色导致细胞器轮廓的不连续标记（由STED图像中的黄色圆圈表示））该方案代表我们目前的假设，表明大的亲和力探针（如上图）可能不能检测到所有可用的表位，小分子如适体（下图）更好地装饰目标结构。

笔记

确定感兴趣的适体的饱和浓度或最佳染色浓度（最佳信噪比），固定染色的孵育时间（例如，60分钟），并测试不同的适体浓度范围为10推荐阳性细胞系中-500nM（或更多）。用不同浓度的适体进行染色，固定和固定后，细胞可以在任何荧光显微镜中成像，荧光强度可以使用ImageJ或MATLAB进行计算。
在定义染色程序的饱和条件后，下一步是测试结合特异性。这是通过评估表达受体的细胞和不表达受体的细胞的染色来实现的。重要的是，阳性细胞和阴性细胞的染色条件，适体浓度和孵育时间必须相同。一旦染色和固定，细胞可以用落射荧光或共焦显微镜成像。阴性细胞系几乎不显示特定的荧光信号。为了适当控制非特异性染色背景，可以平行测定与与特异性靶标结合的适体结合的相同荧光团的随机适体的免疫标记。此控制不应有任何荧光信号。另外的对照是通过使用相同对照的荧光流式细胞术分析来评估结合特异性
每个受体都有自己的内化动力学。在这项工作和协议中，我们打算通过内部化来最大化标签，从而选择更长的孵化时间。
如果适体含有BzdU（5-（N-苄基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷）或任何其他疏水基团，我们建议向阻断溶液中加入硫酸葡聚糖。阻塞溶液中硫酸葡聚糖浓度的优化强烈地降低了由适配体与PLL处理的盖玻片的静电相互作用引起的非特异性结合引起的背景。
如果适配体的非特异性结合仍然存在，则在染色溶液中增加剪切的鲑鱼精子DNA和/或硫酸葡聚糖的浓度。聚阴离子竞争剂/封闭剂硫酸葡聚糖还基本上减少由聚阴离子适体的静电吸引引起的非特异性结合到核中的带正电荷的位点，例如组蛋白。
为了鉴定和定量内质体样结构，强烈推荐共定位研究（Gomes de Castro等人，2017）。

食谱

1M Tris（2-羧乙基）膦盐酸盐储备溶液（TCEP）
100 ml：

加入11.47克TCEP至35毫升冷超纯水
用10N NaOH将pH调至7.0，并将体积调整至100ml
等分成2.0毫升管，储存于-20°C

完成DMEM培养基

补充有10％FBS，4mM L-谷氨酰胺和100U / ml青霉素和链霉素的DMEM
通过真空过滤灭菌
储存于4°C

完成RPMI培养基

补充有10％FBS，4mM L-谷氨酰胺和100U / ml青霉素和链霉素的RPMI
通过真空过滤灭菌
储存于4°C

聚-L-赖氨酸（PLL）储备溶液

在超纯水中制备2 mg / ml储备溶液，并通过0.2μm的注射器过滤器进行消毒
将等分试样储存在-20°C
在无菌罩下准备含有PLL处理的盖玻片的板材
向含有盖玻片的每个孔中加入1毫升0.1毫克/毫升的PLL
在室温下孵育1小时
孵育后，用超纯水洗涤两次，并将板在细胞培养罩内空气干燥
将板储存在4°C直到使用

5倍磷酸缓冲盐水（5倍PBS）

在超纯水中稀释10倍浓缩的PBS储液。用0.2μm注射器过滤器或高压釜过滤细胞培养罩内的溶液。存储在RT
对于1 L 10x浓缩的PBS储备溶液：
14.4克磷酸钠
2.4克磷酸钾
2克KCl
80克NaCl
溶于DNase和RNase-free水中将pH调节至7.4
通过过滤灭菌或高压消毒灭菌
存储在RT

25mM MgCl 2溶液（5×MgCl 2）

在无DNA酶和无RNase的蒸馏水中将1M MgCl 2/2储备液稀释至25mM。为了避免颗粒和污染，请用0.2μm注射器过滤器过滤细胞培养罩内的溶液。在室温下存放
对于100ml的1M MgCl 2 储备溶液：
将20.3g MgCl 2·6H 2 O溶于70ml DNase和RNase-free水中，并将体积调节至100ml
存储在RT

阻塞解决方案
补充有100μg/ ml剪切鲑鱼精子DNA和1mM硫酸葡聚糖硫酸盐的DMEM或RPMI完全培养基
4％多聚甲醛（PFA）
1升PFA 4％制剂：
1. 在玻璃烧杯中加入约600ml的1x PBS至40g的PFA，并使用磁力搅拌器在〜50℃下搅拌。
2. 将pH调节至7到8之间
3. 用1x PBS将体积调节至1L，使其等分并储存在-20°C
注意：PFA毒性很大：处理PFA时请使用手套，实验室护理，呼吸和眼睛保护。
淬火液

0.1M甘氨酸在1x DPBS中
存放在RT，直到使用
准备100ml甘氨酸1M储备溶液：
将7.5 g甘氨酸溶于超纯水中通过0.2μm注射器过滤器过滤，并在RT存储下

的Mowiol ®

混合24g甘油，9.6g Mowiol，4-88试剂，62.4ml蒸馏水和9.6ml 1M Tris缓冲液，圆锥形圆筒，磁力搅拌器5-7天
任选地在40-50℃下加热混合物以溶解Mowiol
沉淀后，将上清液以等分试样（例如，2.0ml管）分离，并在4℃下储存

（可选）缓冲区A
25mM Tris-HCl，pH8
6 M尿素
（可选）缓冲区B
在25mM Tris-HCl pH8,6M尿素中的0.5M NaClO 4

致谢

这里描述的该协议更详细地已经在（Gomes de Castro等人，2017）中公开。这项工作得到了杰出团队和DFG研究中心纳米显微镜和脑分子生理学（CNMPB）的支持。

参考

Fornasiero，EF和Opazo，F.（2015）。细胞生物学家的超分辨率成像：概念，应用，当前的挑战和发展。生物学 37（4）：436-451。
Gomes de Castro，MA，Hobartner，C.和Opazo，F.（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28235049 “target =”_ blank“> Aptamers提供在超分辨率显微镜下研究的细胞受体的优异染色。 PLoS One 12（2）：e0173050。
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