材料和试剂

RPMI-1640培养基（Life Technologies，目录号：11875-093）
胎牛血清（FBS）（GEMBIO，目录号：900-108）
抗生素 - 抗真菌剂（Life Technologies，目录号：15240-062）
抗CD45RA（Dako，目录号：M0754）
抗激活的胱天蛋白酶-3（Cell Signaling Technology，目录号：9665）
抗CD3（AbD Serotec，目录号：MCA1477）
抗IL-7（R& D Systems，目录号：MAB207）
Streck组织固定剂（Streck Laboratories，目录号：265138）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：X-100）
Cell MicroSieves（New York的BioDesign Inc.，目录号：N100S）
Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：A-21206）}
Alexa Fluor 568驴抗小鼠IgG（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A10037）
Alexa Fluor 647鸡抗大鼠IgG（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A-21472）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10010-023）
完成RPMI-1640培养基（见配方）
注意：这里用于人组织样品的实验方案具有完全的IRB批准（Institutional Review Board：Human Subjects Committee，Research Subjects'Protection Program，University of Minnesota），并且从个体患者获得书面同意，或者合法未成年人监护人，在开始手术前在研究应用中使用组织。

设备

生物安全柜
室玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：154526）
离心机
水浴

程序

新鲜人腭扁桃体组织从常规扁桃体获得，并在手术完成的1-2小时内加工。通过迫使切割的组织片通过金属筛（例如CellMicroSieves）并将释放的单细胞悬浮液收集在完全RPMI-1640培养基中来制备活的扁桃体淋巴细胞悬浮液。
将淋巴细胞洗涤两次（离心并将细胞重悬于PBS中），并通过将细胞重悬于冷冻培养基（具有10％DMSO的FBS）中立即冷冻保存。将细胞立即转移至-20℃1小时，然后在-80℃下过夜，然后永久保存在液氮中。
通过在完全RPMI-1640培养基中在37℃下用5％CO 2 2培养留在金属筛（例如CellMicroSieves）上的基质，贴壁增殖成纤维细胞样基质细胞在培养物中2-5天后首先可见，并且在10-25天后形成汇合的单层
对于淋巴细胞和基质细胞的共培养，将从人扁桃体分离的2×10 5个淋巴细胞在没有基质细胞的室玻片中与自体基质细胞（2×10 4个/（2×10 4个细胞/孔）和IL-7阻断抗体（50μg/ml）处理2〜3天。
共培养后，将载玻片在0.5ml Streck组织固定液中固定20分钟，用1％TritonX-100透化5分钟。
载玻片用500μl/孔PBS + 3％FBS洗涤3次，用500μl/孔DPBS + 3％FBS + 0.5％Tween-20在室温下封闭2小时。
除去封闭试剂后，加入250μl/孔一抗[活化的胱天蛋白酶3（1:100稀释），CD45RA（1:100稀释）和CD3（1:100稀释）]，并在室温下孵育1小时。 />
除去第一抗体后，载玻片用500μl/孔PBS + 3％FBS洗涤3次
加入250μl/孔荧光第二抗体，并在室温下孵育1小时
取出二抗，洗涤载玻片，用500μl/孔PBS + 3％FBS洗涤3次
使用荧光显微镜或共焦显微镜量化凋亡幼稚T细胞的数量

食谱

完成RPMI-1640培养基
补充10％热灭活的胎牛血清FBS和1×抗生素 - 抗真菌剂

致谢

该协议改编自Link等人。（2007）和Zeng 等人（2012）。

参考文献

Link，A.，Vogt，T.K.，Favre，S.，Britschgi，M.R.，Acha-Orbea，H.，Hinz，B.，Cyster，J.G.and Luther，S.A。（2007）。淋巴结中的成纤维网状细胞调节幼稚T细胞的内环境稳定。 Nat Immunol 8（11）：1255-1265
Zeng，M.，Southern，P.J.，Reilly，C.S.，Beilman，G.J.，Chipman，J.G.，Schacker，T.W.and Haase，A.T。 HIV-1感染中的淋巴组织损伤会消耗幼稚的T细胞，并限制抗逆转录病毒治疗后的T细胞重建。 PLoS Pathog 8（1）：e1002437。